家蠶基質(zhì)金屬蛋白酶基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)家族是一類蛋白水解酶，能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中大部分蛋白質(zhì)。研究家蠶Bombyxmori基質(zhì)金屬蛋白酶基因，不僅對(duì)研究家蠶變態(tài)發(fā)育的生理調(diào)節(jié)具有重要的理論意義，而且可望通過(guò)對(duì)家蠶模式昆蟲的研究，從更深層次闡明MMPs家族的基因功能及作用機(jī)制。為了研究MMPs在家蠶生理代謝過(guò)程中的作用，本論文的研究工作主要分為以下幾部分： 1.家蠶基質(zhì)金屬蛋白酶基因的

2、克隆及序列分析：利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)和RT-PCR方法，首次從家蠶蛹中克隆了一個(gè)MMP基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為Bm-MMP。序列分析表明，Bm-MMP的mRNA存在兩個(gè)選擇性剪切變體，分別命名為Bm-MMP-V1(GenBank登錄號(hào)：EU496376)和Bm-MMP-V2(GenBank登錄號(hào)：EU496377)。其中Bm-MMP-V1全長(zhǎng)cDNA序列為2257bp，包含一個(gè)1686bp的開放閱讀框，編碼56

3、1個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為62.3kD；Bm-MMP-V2cDNA序列全長(zhǎng)為2188bp，包含一個(gè)1617bp的開放閱讀框，編碼538個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為59.9kD。基因結(jié)構(gòu)分析顯示，Bm-MMP具有13個(gè)外顯子，選擇性剪切位點(diǎn)在第12外顯子上。Bm-MMP-V2的編碼區(qū)序列比Bm-MMP-V1的編碼區(qū)序列缺少69個(gè)核苷酸，其余核苷酸序列相似性為100％。氨基酸序列分析顯示，Bm-MMP具有基質(zhì)金屬蛋白酶家族的典型結(jié)構(gòu)特征：信

4、號(hào)肽序列、前肽區(qū)、催化區(qū)、鉸鏈區(qū)及血紅素蛋白類似區(qū)，其中催化區(qū)存在一個(gè)保守序列，為催化活性中心。 對(duì)氨基酸序列同源性分析表明，Bm-MMP-V1和Bm-MMP-V2的氨基酸序列與蠟螟Galleriamellonella的Gm1-MMP的氨基酸序列同源性最高，均為88.8％；與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的Dm1-MMP氨基酸序列同源性，分別為61.2％和64.3％。 2.原核表達(dá)：將Bm-MMP-

5、V1的編碼區(qū)克隆到表達(dá)載體pET28a(+)，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析結(jié)果表明，帶有6×His標(biāo)簽，大小約為62kD的融合蛋白成功表達(dá)。 3.Bm-MMP基因在家蠶中不同發(fā)育時(shí)期及免疫刺激的表達(dá)特征：半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，Bm-MMP-V1和Bm-MMP-V2在4齡眠蠶、熟蠶、吐絲后36h及48h、預(yù)蛹中的表達(dá)量比5齡中食期與化蛹后的表達(dá)量高，推測(cè)該基因與家蠶幼

6、蟲蛻皮變態(tài)有關(guān)；脂多糖(LPS，細(xì)菌細(xì)胞壁成分)誘導(dǎo)5齡3d的幼蟲，其Bm-MMP-V1和Bm-MMP-V2在血液中的表達(dá)量升高，推測(cè)Bm-MMP可能與免疫相關(guān)。 本研究首次在家蠶中克隆了家蠶基質(zhì)金屬蛋白酶(Bm-MMP)基因全長(zhǎng)cDNA序列，分析了其序列的結(jié)構(gòu)特征，并研究了該基因在大腸桿菌中的原核表達(dá)，推測(cè)Bm-MMP具有蛋白水解酶活性。通過(guò)對(duì)Bm-MMP在不同發(fā)育時(shí)期及免疫刺激后的表達(dá)特征研究，推測(cè)該基因可能與家蠶變態(tài)發(fā)育及