家蠶先天免疫相關(guān)基因Bmimd的克隆、表達(dá)及序列分析.pdf

1、家蠶是人類利用較早的經(jīng)濟(jì)昆蟲,也是經(jīng)典遺傳學(xué)研究的模式生物之一。家蠶對病害的免疫力差，一直威脅著蠶業(yè)生產(chǎn)，所以蠶體免疫的研究不僅具有重要的產(chǎn)業(yè)價值，而且具有模式研究的科學(xué)意義。研究表明，昆蟲受到不同的微生物感染時，能誘導(dǎo)不同的抗菌肽基因表達(dá)，而這些抗菌肽基因的表達(dá)主要受兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，即Toll途徑和Imd(immune deficiency)途徑。imd基因是Imd途徑中的一個關(guān)鍵基因，該基因在各個物種中的同源性很低，對其作用

2、知之甚少，現(xiàn)代分子生物學(xué)及遺傳學(xué)等先進(jìn)技術(shù)為其研究提供了有力的工具。本文擬在借鑒其它模式生物(特別是果蠅)中的先進(jìn)研究成果，基于家蠶全基因組信息，對imd基因在家蠶中的同源體Bmimd進(jìn)行研究，為提高蠶體抗病能力打下基礎(chǔ)，同時為研究家蠶免疫機(jī)制提供理論依據(jù)，并可為昆蟲免疫應(yīng)答的分子機(jī)制研究提供極有價值的線索。 本研究的內(nèi)容與結(jié)果如下： 1家蠶imd基因的克隆及序列分析利用家蠶EST數(shù)據(jù)電子克隆了果蠅imd基因在家蠶中的同

3、源體，命名為Bmimd。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Bmimd全長1092bp，由3個內(nèi)含子和4個外顯子構(gòu)成，編碼250個氨基酸，蛋白預(yù)測分子量28.6kD，等電點是6.45。SignalP在線查找發(fā)現(xiàn)，Bmimd編碼的第1到19個氨基酸為信號肽。結(jié)構(gòu)域分析表明，Bmimd基因在第152個氨基酸到246個氨基酸之間含有一個致死結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)序列比對和Clustalx聚類分析表明，Bmimd的碳末端致死結(jié)構(gòu)域與哺乳動物的致死結(jié)構(gòu)域蛋白RIP相

4、似。根據(jù)預(yù)測序列設(shè)計引物，體外克隆Bmimd基因的編碼區(qū)序列，得到一條長為750bp的目的片段，包含該基因完整的編碼區(qū)。 2家蠶Bmimd基因的原核表達(dá)將Bmimd基因整個編碼區(qū)序列亞克隆到PET-50b(+)表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌株。通過IPTG誘導(dǎo)重組菌imd/PET-50b/BL-21表達(dá)蛋白，得到一個約97kD的重組蛋白，其中標(biāo)簽(含兩個6×His Tag和一個Nus·Tag)蛋白

5、約68kD，目的蛋白約29kD，與預(yù)測分子量相符合。表達(dá)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最佳的誘導(dǎo)條件為37℃、0.4mmol/LIPTG誘導(dǎo)5h。蛋白組分鑒定表明，誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)。 3家蠶imd基因表達(dá)特性研究利用家蠶全基因組芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)對Bmimd基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在5齡3天家蠶頭中的表達(dá)量最高，在生殖腺、表皮和脂肪體中也有一定的表達(dá)，而在血液、馬氏管和絲腺中幾乎不表達(dá)。 通過親和層析和電洗脫的方

6、法純化原核表達(dá)的Bmimd蛋白，制備抗體；Western blotting分析5齡4天家蠶imd蛋白在各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果與芯片分析結(jié)果相似，表明Bmimd基因在五齡末期家蠶各個組織中的mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平一致，由此推測家蠶對imd基因的調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。 綜上所述，本文成功的找到了昆蟲先天免疫關(guān)鍵基因imd在家蠶中的同源體Bmimd,并對Bmimd進(jìn)行了體外克隆和序列分析，進(jìn)而原核表達(dá)獲得并純化出Bmim

7、d蛋白，最后對該基因在五齡末期家蠶各個組織中的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。從實驗結(jié)果中可以推測出以下結(jié)論：(1)Bmimd可能是家蠶先天免疫信號傳遞Imd途徑中的一種配體，能夠傳遞病原刺激信號。(2)家蠶對imd基因的調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，所以一旦受到病原刺激，機(jī)體可以在較短的時間內(nèi)表達(dá)出該蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體表達(dá)出大量的抗病效應(yīng)物，以最快的速度抵御病原的感染。(3)家蠶Imd信號途徑極有可能與果蠅一樣，不僅參與全身性體液免疫，還與局部免疫有