家蠶Slp基因的克隆表達(dá)及凋亡功能研究.pdf

1、家蠶30K蛋白是家蠶5齡幼蟲時(shí)期血淋巴中表達(dá)量最高的蛋白，是家蠶發(fā)育時(shí)期主要的能源物質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能。目前已經(jīng)報(bào)道的家蠶30K蛋白共有5種，分別為BmLp-C6、BmLp-C12p、BmLip19G1、pBmHPC-21和pBmHPC-23。根據(jù)己知的5種30K蛋白的氨基酸序列，利用NCBI在線BLAST工具在家蠶蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，發(fā)現(xiàn)一種蛋白(Slp)的氨基酸序列（蛋白序列號(hào)為NP001119728）與已知的5種家蠶

2、30K蛋白氨基酸序列相似度均達(dá)到41％以上，且具有共同的保守結(jié)構(gòu)域Lipoprotein-11，它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)也極其相似，因此，推測其可能是家蠶30K蛋白家族新成員。
　　 為了研究Slp蛋白功能，本研究利用NCBI查找獲得了編碼SIp蛋白的基因序列，然后利用RT-PCR技術(shù)從家蠶五齡幼蟲脂肪體中克隆得到slp的cDNA序列，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。利用鎳親和層析法獲得的純化SIp蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，用于該蛋白

3、的亞細(xì)胞定位和組織表達(dá)分析。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，SIp在BmN細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中;蛋白免疫印跡法檢測Slp蛋白在家蠶不同發(fā)育時(shí)期與5齡家蠶不同組織中的表達(dá)分布情況，結(jié)果顯示該蛋白在5齡幼蟲期的表達(dá)量最高，蛹期次之，蛾期和卵期最少;Slp在5齡幼蟲血淋巴和脂肪體中表達(dá)量最高，在其他組織中表達(dá)量較少。
　　 已有研究結(jié)果表明家蠶血淋巴具有抗凋亡活性，而起主要抗凋亡作用的即為家蠶30K蛋白。因此，我們推測Slp蛋白也具

4、有相似的生物學(xué)活性。為了研究Slp蛋白的生物學(xué)功能，利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-BacSystem)，在BmN細(xì)胞中表達(dá)、純化了Slp蛋白。將純化的Slp蛋白作用于H202處理的BmN細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞中，MTT檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示Slp蛋白在一定程度上可增強(qiáng)H202誘導(dǎo)的兩種細(xì)胞的活力;ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)DNA片段化，結(jié)果顯示Slp蛋白也可降低細(xì)胞內(nèi)DNA的片段化程度。上述研究結(jié)果表明家蠶SIp蛋白對(duì)H2O2處理的