家蠶翅模式?jīng)Q定基因的克隆、表達及功能研究.pdf

1、昆蟲是地球上最早在空中飛行的動物，也是目前地球上種類最多、分布最廣的一類生物。翅的發(fā)生使昆蟲在覓食、尋偶、擴大分布和避敵等多方面獲得了優(yōu)越的競爭能力，是昆蟲綱成為最繁榮的生物類群的重要原因。翅的特征也是研究分類和演化的重要依據(jù)。隨著分子生物學的發(fā)展，迄今已取得了大量關(guān)于昆蟲翅發(fā)育的研究成果，并表明翅發(fā)育的基本機制在昆蟲間是比較保守的。但在漫長的進化歷程中，主要由于自然選擇的結(jié)果，昆蟲翅的形態(tài)和功能出現(xiàn)了許多不同的類型，這些形態(tài)上的差異究

2、竟源于哪些遺傳信息的改變?其中的分子調(diào)控機制又是怎樣的?這些問題需要深入研究。 家蠶是鱗翅目昆蟲的典型模式，也是目前完成基因組測序的唯一一種鱗翅目昆蟲。家蠶翅發(fā)育相關(guān)基因的研究，對昆蟲生理學、發(fā)育生物學以及生物進化等都具有重要的價值。家蠶在長期的人工選擇壓力下，已喪失了飛行能力，翅上斑紋嚴重退化，通過研究參與家蠶翅發(fā)育的基因，為揭示家蠶翅功能整體退化的分子機理奠定重要理論基礎，對鱗翅目害蟲的生物防治有重要意義。 本研究借

3、鑒模式生物果蠅關(guān)于翅的研究成果，利用家蠶的全基因組序列、ESTs以及基因芯片數(shù)據(jù)，對家蠶翅發(fā)育相關(guān)基因進行了生物信息學分析，同時采用克隆、RT-PCR、原位雜交和RNA干涉等技術(shù)對部分基因的表達以及功能進行了研究。獲得的主要結(jié)果如下： 1.家蠶翅模式?jīng)Q定基因的生物信息學分析 前后軸和背腹軸兩個級聯(lián)調(diào)控途徑對果蠅翅模式形成起著非常重要的作用，其中主要包括22個基因。通過同源檢索，我們發(fā)現(xiàn)除vestigial(vg)基因外，

4、其余21個基因在家蠶基因組中均存在同源基因。這些決定翅模式形成的基因大多在蝴蝶中也都有報道。這一結(jié)果表明，鱗翅目和雙翅目昆蟲翅模式?jīng)Q定的級聯(lián)調(diào)控途徑比較保守。 分析家蠶和果蠅翅模式?jīng)Q定基因的結(jié)構(gòu)和功能域，結(jié)果表明相應基因功能域序列相似性很高，進一步說明它們在翅發(fā)育中扮演著較為相似的角色。同時，部分基因(如Ubx，Dll等)在功能域外也表現(xiàn)目(如雙翅目)的特異性。推測是由于昆蟲在進化過程中翅的形態(tài)發(fā)生分化，相應基因的功能及其調(diào)控方

5、式略顯差異，使得在進化中其基因結(jié)構(gòu)漸漸分化而表現(xiàn)出各自種群的特征。 2.家蠶翅的形態(tài)發(fā)生與基因表達模式研究 以N4為實驗材料，觀察家蠶5齡幼蟲到化蛾前各時期翅原基及蛹翅(翅芽)的形態(tài)特征，表明5齡幼蟲翅原基生長緩慢；蠶老熟后翅原基則迅速生長，其上的氣管明顯增多；化蛹前(W2末期)，翅原基已經(jīng)展開，與蛹初期翅芽大小相當?；己?，蛹的翅芽包被于表皮之下，整個蛹期，翅芽的大小和形狀都沒有太明顯的變化，只是翅芽發(fā)育逐步完善的過程

6、，包括翅脈的硬化、鱗片的形成、花紋的出現(xiàn)等。在化蛹后第2d(P2)始見翅脈逐步形成，第3d(P3)可見翅芽的邊緣出現(xiàn)初生的鱗毛，第6d(P6)鱗毛和翅脈基本形成。同時，對5齡幼蟲的翅原基進行石蠟組織切片，調(diào)查了在發(fā)育過程中翅原基內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。 基于對家蠶翅模式?jīng)Q定基因的生物信息學分析結(jié)果，調(diào)查這些基因在翅發(fā)育過程中的表達模式。結(jié)果顯示決定翅模式的基因在家蠶翅發(fā)育過程中都有大量表達。幼蟲期，多數(shù)基因的表達量都呈逐漸升高的趨勢；化

7、蛹后，其表達量逐漸降低；羽化前，幾乎所有這些基因都不再表達。從整體上看，這些基因的表達高峰主要集中在幼蟲末期到化蛹初期，如wg,hh,srf,fng等。形態(tài)觀察的結(jié)果表明這段時期正是翅原基形態(tài)發(fā)生巨大變化的時候，推測這些基因的高表達與翅原基的形態(tài)變化有關(guān)。同時部分基因在化蛹后仍維持較高水平的表達，如inv，fng，cut，wg等，推測可能是因為這些基因除了決定翅的模式外還參與后期翅的形態(tài)特化，如翅脈、鱗毛和斑紋的發(fā)育等。 3.翅

8、葉發(fā)育重要基因Bmwnt-1的研究 參考人、果蠅、海葵的38個Wnt蛋白序列，通過序列比對，在家蠶9倍基因組中，找到9個同源基因，基于序列相似性，將其命名為：Bmwnt1，Bmwnt4A，Bmwnt5B，Bmwnt6，Bmwnt7，Bmwnt10A，Bmwnt10B，Bmwnt11和Bmwnt11A。在不同物種中，Wnt基因的數(shù)量不同。人的基因組有19個Wnt基因、低等的?？?2個。而在昆蟲(家蠶、果蠅和赤擬谷盜)中，Wnt基

9、因的數(shù)量偏少，推測Wnt基因在進化過程中可能有基因丟失的現(xiàn)象，尤其在昆蟲中。但Wnt的基因結(jié)構(gòu)在進化過程中是比較保守的，常以成串的方式排列。家蠶有2個Wnt基因簇，Wntll-Wnt1-Wnt6-Wnt10和Wnt7-Wnt5B-Wnt4，分別位于4號和28號染色體上。 家蠶的Bmwnt-1基因是Wnt1亞型的一個同源體。分析雙翅目和鱗翅目昆蟲的Wnt1蛋白的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)盡管Wnt-1蛋白在不同物種內(nèi)都有較保守的結(jié)構(gòu)域，但在進

10、化過程中該結(jié)構(gòu)域也在不斷地分化，在目間表現(xiàn)出明顯的差異性。 對Bmwnt-1基因在翅發(fā)育過程中的表達譜分析表明，Bmwnt-1在5齡幼蟲的翅原基中的表達量較高，一直持續(xù)到上簇后第2d(W2)，化蛹后，Bmwnt-1的表達量逐漸降低。用Bmwnt-1dsRNA沉默該基因在翅原基中的表達，出現(xiàn)翅葉部分缺失，甚至完全消失的突變表型，不能很好的形成翅葉。由此說明家蠶的Bmwnt-1控制翅葉的發(fā)育。 4.家蠶AS-C comple

11、x的研究 鑒定了家蠶AS-C復合物，包括BmASH、BmASH2、BmASH3和Bmase 4個基因。通過序列的同源性分析得出家蠶BmASH、BmASH2、BmASH3是原神經(jīng)基因，Bmase是神經(jīng)前體基因。 進化分析表明，AS-C complex的祖先最初就分化為原神經(jīng)基因和神經(jīng)前體基因。在大多數(shù)的昆蟲中都只有這2個AS-C基因。但雙翅目昆蟲中，AS-C complex經(jīng)歷基因重復后分化出了4個基因，本研究發(fā)現(xiàn)家蠶有4

12、個AS-C基因，是除雙翅目以外的首例發(fā)現(xiàn)。不同物種中，盡管AS-C基因數(shù)目不同，但AS-C complex及其兩側(cè)基因的結(jié)構(gòu)是非常保守的，遵循著一定的排列方式，即原神經(jīng)基因位于神經(jīng)前體基因的上游，在AS-C complex的兩側(cè)緊挨著一個yellow基因和一個細胞色素基因cyt P450。 用半定量RT-PCR調(diào)查了4個AS-C基因在家蠶不同組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在翅原基中的表達量明顯高于其他組織。進一步檢測它們在翅發(fā)育過程中

13、的表達，結(jié)果表明這4個AS-C基因都有較高的表達水平，其中BmASH2和BmASH3基因的表達模式非常相似，呈現(xiàn)共表達的趨勢。在蝴蝶里，鱗毛前體細胞的第一次細胞分裂發(fā)生在化蛹后的24h左右，bASHl基因(蝴蝶AS-C的同源基因)在此時大量表達。在家蠶中，對應的時期里高表達的是BmASH基因，推測家蠶的BmASH基因與鱗毛的分化關(guān)。我們用RNAi研究BmASH基因的功能，BmASH基因干涉后出現(xiàn)翅表面部分區(qū)域鱗片缺失的現(xiàn)象，且該區(qū)域毛孔

14、也極少。表明BmASH基因在家蠶翅鱗毛的形成過程中起著至關(guān)重要的作用。 5.dBmSRF基因的功能研究 克隆家蠶的血清應答因子BmSRF基因。BmSRF基因在翅發(fā)育過程的表達模式分析和翅原基中的原位雜交結(jié)果都表明，該基因參與翅的發(fā)育，主要的作用時期是化蛹后1、2d(P1、P2)。說明BmSRF基因?qū)Τ岬男螒B(tài)特化具有非常重要的作用。我們用BmSRF dsRNA沉默該基因在翅原基中的表達，出現(xiàn)了翅葉上有囊泡和翅脈增多這兩種突

15、變表型，同時還伴有鱗毛增多的現(xiàn)象。初步認為BmSRF對翅的上下表皮的粘合和脈絡的形成有重要作用。 BmSRF基因干涉后出現(xiàn)了囊泡型翅的突變表型。該表型與家蠶突變螯蝦蛹(cf)的表型較為相似，這引起了我們探究家蠶螯蝦蛹突變形成原因的極大興趣。通過對螯蝦蛹和正常型翅原基的解剖，我們觀察到在上簇后第1d(W1)，突變型cf的翅原基中的氣管的數(shù)量明顯比野生型多，且較野生型顯得凌亂，生出一些微氣管。進一步對該時期二者的翅原基進行切片，觀察

16、發(fā)現(xiàn)在W1期野生型翅原基中氣管發(fā)生遷移，而突變體cf的翅原基中其氣管在遷移過程中極度拉長，并伴有氣管融合的現(xiàn)象。鑒于此，我們用定量PCR檢測了BmSRF基因在突變型cf和野生型翅發(fā)育過程中的表達情況。 結(jié)果顯示在突變型cf里BmSRF基因的表達水平比野生型高，尤其在上簇后第1d(W1)。這與我們對二者翅原基的形態(tài)觀察結(jié)果一致，說明W1期是突變體cf形成的重要時期，推測BmSRF基因在該時期的過量表達或許是導致突變體cf形成的一個