家蠶假想基因Bm-P312的克隆表達(dá)及其定位研究.pdf

1、從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選獲得一條閱讀框?yàn)?70 bp,編碼289個(gè)氨基酸殘基的基因,GenBank登陸號(hào)為:DN237560,在NCBI上對該序列進(jìn)行同源性比對后初步確定其為家蠶中的一未知基因(假想基因),并命名為Bm-P312(Bombyxmori-P312)。將家蠶Bm-P312序列與家蠶基因組序列比對,結(jié)果表明該基因由一個(gè)外顯子組成。從NCBI數(shù)據(jù)庫中利用Blast檢索,發(fā)現(xiàn)Bm-P312蛋白與已知蛋白沒有同源性,

2、與其他假想或者預(yù)測蛋白的同源性都低于30％,說明Bm-P312蛋白是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能未知的蛋白。
　　 我們根據(jù)開放閱讀框設(shè)計(jì)上下游引物,PCR擴(kuò)增目的基因,將擴(kuò)增到的Bm-P312基因經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切插入到融合表達(dá)載體pET-28a(+)的相應(yīng)酶切位點(diǎn),構(gòu)建了重組融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Bm-P312,經(jīng)PCR、酶切鑒定驗(yàn)證重組成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)終濃度1 mM的IPTG誘

3、導(dǎo)工程菌表達(dá)后,SDS-PAGE分析表明在37 kD左右的位置有一條特異性蛋白條帶,與預(yù)期值37.1 kD(融合標(biāo)簽分子量3.8 kD,Bm-P312蛋白理論分子量33.27 kD)相符,重組蛋白主要存在于可溶的形式(菌上清)中。
　　 通過鎳柱親和層析法純化了重組蛋白,并使用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,ELISA檢測抗體效價(jià)大于1:12800,Western blotting檢測抗體特異性較好。以家蠶Bm5細(xì)胞進(jìn)

4、行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,Bm-P312蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 利用熒光定量PCR的方法,對家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個(gè)發(fā)育時(shí)期,以及五齡幼蟲各組織中Bm-P312的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較,分析發(fā)現(xiàn)在蛹期和生殖器、頭部中轉(zhuǎn)錄水平較高。提取家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個(gè)發(fā)育時(shí)期及五齡幼蟲各組織的總蛋白,進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,Bm-P312蛋白在家蠶的蛹期以及生殖器、頭部、絲腺中有較高量表達(dá),轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況相對比較