鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白作為免疫佐劑的研究.pdf

1、鞭毛是沙門菌運(yùn)動(dòng)性的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，鞭毛蛋白是鞭毛絲狀部組成元件。鞭毛蛋白被認(rèn)為是一種保護(hù)性抗原用于針對(duì)沙門菌的疫苗研究，同時(shí)它還是Toll樣受體5(Toll-like receptor5，TLR5)的配體，與之結(jié)合后可誘導(dǎo)產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答。近年來(lái)研究結(jié)果表明，鞭毛蛋白作為天然免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然免疫應(yīng)答可幫助建立針對(duì)外源抗原的獲得性免疫應(yīng)答，從而顯示出鞭毛蛋白作為免疫佐劑的特性。
　　 禽流感(Avian influen

2、za,AI)是由正黏病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒引起的一種禽類的急性高度接觸性、致死性傳染病，被國(guó)際獸疫局(OIE)列為法定通報(bào)疾病。由于近年來(lái)包括H5N1亞型在內(nèi)的一些禽流感病毒能夠跨種感染人并引起人類疾病，所以引起了各國(guó)醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注?；|(zhì)蛋白2(M2)是禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)表面的第三大跨膜蛋白，它在禽流感病毒各亞型的不同毒株之間都具有很高的同源性。研究結(jié)果表明，M2蛋白具有

3、較好的抗原性，且其主要抗原決定簇位于M2蛋白的胞外區(qū)M2e。
　　 新城疫(Newcastle disease，ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一，被OIE確定為法定通報(bào)疾病，免疫預(yù)防是控制該病的重要手段之一。位于新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)囊膜上的融合蛋白(F)除了參與病毒的穿透、細(xì)胞融合，與病毒的致病性有關(guān)外，還具有良好的免疫原性，是NDV主要的保護(hù)性抗原。
　　 為此，本研究

4、以鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白作為研究對(duì)象，構(gòu)建了展呈AIV M2e表位的重組嵌合鞭毛蛋白，以及鞭毛蛋白與NDV F蛋白部分表位串聯(lián)表達(dá)的融合蛋白，并分別對(duì)它們的免疫原性進(jìn)行了初步的分析，以期分析該鞭毛蛋白的免疫佐劑效應(yīng)。
　　 1.鞭毛蛋白展呈禽流感病毒M2e表位及其免疫原性分析
　　 以重組質(zhì)粒pET-fliC為模板，應(yīng)用引物fliC-A、fliC-C擴(kuò)增fliC基因上游部分fliC-AC；引物fliC-D、fliC-B擴(kuò)增

5、fliC基因下游部分fliC-DB；人工合成兩個(gè)拷貝的H5N1亞型禽流感病毒M2e(aa2-24)表位基因M2e2，利用overlap PCR技術(shù)，以fliC-AC和M2e2基因?yàn)槟０澹瑧?yīng)用引物fliC-A、M2-F擴(kuò)增fliC-AC-M2e2基因片段；最后以fliC-AC-M2e2和fliC-DB為模板，應(yīng)用引物fliC-A、fliC-B擴(kuò)增嵌合基因片段fliC/M2e2，從而將M2e2基因插入沙門菌鞭毛蛋白基因fliC高變區(qū)。將嵌合

6、基因片段fliC/M2e2克隆到質(zhì)粒pET30a+上，獲得重組質(zhì)粒pET-fliC/M2e2。
　　 將質(zhì)粒pET-fliC/M2e2通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化鼠傷寒沙門菌LB5000，重組菌命名為L(zhǎng)B5000(fliC/M2e2)。應(yīng)用P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將fliC/M2e2基因?qū)攵及亓稚抽T菌SL5928的基因組中，對(duì)初篩具有運(yùn)動(dòng)性的轉(zhuǎn)導(dǎo)菌進(jìn)行PCR鑒定，以轉(zhuǎn)導(dǎo)菌全基因組為模板，擴(kuò)增fliC/M2e2基因和M2e2基因；PCR鑒定結(jié)

7、果陽(yáng)性的轉(zhuǎn)導(dǎo)菌再穿刺半固體培養(yǎng)基，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析并對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)菌進(jìn)行透射電鏡觀察；動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果陽(yáng)性的轉(zhuǎn)導(dǎo)菌再進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)鑒定；最后，提取鑒定結(jié)果陽(yáng)性的轉(zhuǎn)導(dǎo)菌的鞭毛蛋白，以鼠抗鼠傷寒沙門菌fliC鞭毛蛋白多抗血清為一抗，對(duì)提取的鞭毛蛋白進(jìn)行Western blot分析。將以上所有鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)導(dǎo)菌命名為SL5928(fliC/M2e2)。
　　 提取重組菌SL5928(fliC/M2e2)的重組嵌合鞭毛蛋白fliC/M2

8、e2，以50μg/只的劑量通過(guò)皮下注射途徑免疫C3H/HeJ小鼠。ELISA檢測(cè)各免疫組小鼠針對(duì)M2e2蛋白的特異性血清抗體，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，二免第14天，fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫組的抗體效價(jià)與空白對(duì)照組之間呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，fliC鞭毛蛋白免疫組和M2e蛋白免疫組與空白對(duì)照組之間不呈現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。說(shuō)明本研究所構(gòu)建的fliC/M2e2嵌合基因能夠在沙門菌中表達(dá)，且表達(dá)的重組嵌合鞭毛蛋

9、白fliC/M2e2能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)M2e表位的特異性血清抗體。
　　 2.鞭毛蛋白與新城疫病毒F蛋白的融合表達(dá)及其產(chǎn)物對(duì)小鼠的免疫原性分析
　　 以重組質(zhì)粒pET-fliC為模板，應(yīng)用引物FF1、FF2擴(kuò)增鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白fliC基因；以重組質(zhì)粒pVAX1-F為模板，應(yīng)用引物FF3、FF4擴(kuò)增含有新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)F蛋白部分表位的基因片段F(aa147-344)；通

10、過(guò)柔性肽(Gly4Ser)2編碼基因?qū)liC基因和F基因串聯(lián)，獲得fliC-F基因片段；將fliC-F基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a+上，獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-fliC-F。
　　 將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-fliC-F轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)，獲得重組原核表達(dá)菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)。對(duì)重組原核表達(dá)菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行變性

11、、復(fù)性、透析和濃縮，獲得可溶性fliC-F融合蛋白。以鼠抗fliC蛋白或鼠抗F蛋白多抗血清作為一抗，對(duì)fliC-F融合蛋白進(jìn)行Western blot分析。分析結(jié)果顯示，兩種多抗血清均能特異性識(shí)別fliC-F融合蛋白。說(shuō)明，fliC-F融合蛋白中的fliC蛋白和F蛋白成分能獨(dú)立地保持各自的天然構(gòu)象。
　　 將fliC-F融合蛋白以100μg/只的劑量，通過(guò)皮下注射途徑免疫C3H/HeJ小鼠。ELISA檢測(cè)各免疫組小鼠針對(duì)F蛋白的

12、特異性血清抗體，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，二免第14天和二免第21天，fliC-F蛋白免疫組的抗體效價(jià)與空白對(duì)照組之間呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；二免第14天，F(xiàn)蛋白油乳劑免疫組的抗體效價(jià)與空白對(duì)照組之間也呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；F蛋白免疫組和fliC蛋白免疫組與空白對(duì)照組之間，在各階段均不呈現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果說(shuō)明，本研究中原核表達(dá)的fliC-F融合蛋白能誘導(dǎo)C3H/HeJ小鼠產(chǎn)生針對(duì)F蛋白的特異性血