免疫佐劑及其應(yīng)用

1、新型佐劑研究及其應(yīng)用概況,一、概論,凡是可以增強(qiáng)抗原特異性免答的物質(zhì)均稱為佐劑。,1、佐劑的定義,(adjuvant）一詞來(lái)源于拉丁語(yǔ)，原為輔助之意。在免疫學(xué)和生物制品學(xué)上又稱為免疫佐劑（immunologic adjuvant）。傳統(tǒng)的概念為：當(dāng)一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時(shí)注射于動(dòng)物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮其輔佐作用者，都稱之為佐劑。,2、作用特點(diǎn),①能明顯增強(qiáng)多糖或多肽等抗原性微弱的物質(zhì)誘

2、導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答； ②用最少量的抗原和最少的接種次數(shù)刺激機(jī)體可產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答和高滴度的抗體，在血流或粘膜表面能維持較長(zhǎng)的時(shí)間，發(fā)揮持久的效果。,3、佐劑的作用,①改變正常免疫機(jī)能，吸引大量巨噬細(xì)胞以吞噬抗原；②改變抗原的構(gòu)型，使抗原物質(zhì)降解并加強(qiáng)其免疫原性；③延長(zhǎng)抗原在組織內(nèi)的貯存時(shí)間，使抗原緩慢降解和緩釋，并發(fā)揮免疫系統(tǒng)的細(xì)胞間協(xié)同作用（巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞，T細(xì)胞與B細(xì)胞）。,4、作用機(jī)理,①抗原遞呈（anti

3、gen presentation） 指抗原分子遞呈給T細(xì)胞的方法?？乖f呈的方法對(duì)免疫應(yīng)答的實(shí)質(zhì)和強(qiáng)度有重要影響。佐劑與疫苗的聯(lián)合使用，有助于抗原性物質(zhì)在胞內(nèi)被加工，被MHC分子特異性的結(jié)合、保護(hù)、運(yùn)輸并遞呈給效應(yīng)細(xì)胞。,②抗原尋的（antigen targeting）,指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞的效率。佐劑對(duì)于抗原尋的涉及到的一系列機(jī)制，包括吸引巨噬細(xì)胞到達(dá)組織部位、活化吞噬細(xì)胞、促進(jìn)抗原與細(xì)胞受體的結(jié)

4、合等有重要作用。,③免疫調(diào)節(jié)（immune modulation）,是指任何可以修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)抗原或表位進(jìn)行加工的機(jī)制。通過(guò)這種機(jī)制，可以改變特異性免疫應(yīng)答的本質(zhì)或強(qiáng)度。T細(xì)胞有Th1和Th2兩個(gè)亞類。同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應(yīng)。因此，通過(guò)篩選特定的佐劑，可以達(dá)到誘導(dǎo)正確的免疫應(yīng)答的目的。,二、佐劑分類,按佐劑物理性質(zhì)，分為顆粒型佐劑和非顆粒型佐劑；按佐劑的生物學(xué)性質(zhì)（即Ballanti分類法），可分為微

5、生物及其組分與非微生物物質(zhì)；按佐劑在體內(nèi)存留的時(shí)間，則可分為貯存型佐劑（depot type adjuvant）和非貯存型（non-depot type adjuvant）。顆粒型佐劑多半屬于貯存型的，非顆粒型佐劑大多屬于非貯存型佐劑。,（一）顆粒性佐劑,1．鹽類佐劑：包括氫氧化鋁膠、各種明礬、磷酸鋁等。2．油水乳劑佐劑 ：如弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant, FCA）、弗氏不完全佐劑（Freun

6、d’s incomplete adjuvant, FIA）和礦物油白油佐劑。3．免疫刺激復(fù)合物（ISCOM）佐劑。,顆粒性佐劑,4．蜂膠佐劑（propolis）。5．脂質(zhì)體佐劑（liposomes）。6．其他：MF59佐劑、微囊化佐劑（microencapsulation）、硬脂酰酪氨酸佐劑（slearyltyrosine）和γ－菊粉（gamma-inulin）等。,（二）非顆粒性佐劑,1．肽類佐劑（peptides）：如胞壁酰二

7、肽（MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽（desmuramyl peptides）、脂肽（lipopeptides）和免疫調(diào)節(jié)多肽（immunomodulatory peptides）等。2．表面活性分子類佐劑（surface-active molecules）：如非離子阻斷共聚物表面活性劑（nonionic block copolymers）和海藻糖合成衍生物（TDM）等。,非顆粒性佐劑,3．核酸及其衍生物類佐劑（nucleic aci

8、d derivatives）：如合成核苷酸聚合體（synthetic olynucleotides）、次黃嘌呤衍生物（hypoxanthine derivatives）和免疫刺激序列DNA（CpG DNA或CpG 寡聚脫氧核苷酸（CpG-ODN））等。,非顆粒性佐劑,4．含硫復(fù)合物類佐劑（suiphur-containing compounds）：如左旋咪唑（levamisole）。5．碳水化合物高分子類佐劑（carbohydrate

9、 polymers）：如香菇多糖（lentinan）、硫酸多糖（sulfated polysaccharides）等其他一些多糖和DEAE-葡聚糖等。6．細(xì)胞因子類佐劑（cytokine）：如白介素-1（IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）和γ-干擾素（γ-IFN）等。,非顆粒性佐劑,7．脂質(zhì)分子類佐劑（lipid molecules）：如脂多糖及其衍生物（lipopolysaccharide derivativ

10、es），一些脂溶性維生素（fat-soluble vitamins）如維生素A和維生素E等。8．其他：包括一些蛋白毒素如霍亂毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破傷風(fēng)類毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；維生素B12等。,常規(guī)佐劑和新型免疫佐劑,目前，鋁鹽類佐劑、油水乳劑佐劑和蜂膠佐劑等比較常用，屬于常規(guī)佐劑。細(xì)胞因子類佐劑、 CpG DNA、基因工程減毒素、免疫刺激復(fù)合物佐劑、脂質(zhì)體佐劑及MF59佐劑等是目前研究的熱點(diǎn)，其中有些也已

11、經(jīng)開(kāi)始用于生產(chǎn)實(shí)際，屬于新型免疫佐劑。,三、常規(guī)免疫佐劑,（一）鋁鹽類佐劑該類佐劑在生物制品上應(yīng)用廣泛，對(duì)體液免疫作用很明顯，與抗原混合注射時(shí)，可通過(guò)抗原尋的過(guò)程顯著增高抗體滴度?？扇苄钥乖c此類佐劑混合后成為凝膠狀態(tài)，可建立一個(gè)短時(shí)的貯存顆粒，將可溶性抗原轉(zhuǎn)化為一種便于吞噬的形式，以利于巨噬細(xì)胞吸附。,1．氫氧化鋁膠,又稱鋁膠，其佐劑活性與質(zhì)量密切相關(guān)，質(zhì)優(yōu)的鋁膠分子細(xì)膩、膠體性良好、穩(wěn)定，吸附力強(qiáng)，保存兩年后其吸附力不變。鋁膠可用

12、于制造多種獸用疫苗。各廠家采用不同的合成方法制備鋁膠，優(yōu)點(diǎn)各異。,制法,（1）用鋁粉加燒堿合成法：用量按下列反應(yīng)式計(jì)算： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2OA12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明礬加碳酸鈉合成法：用量按下列反應(yīng)式計(jì)算：2 KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3N

13、a2SO4+3CO2↑。（3）用三氯化鋁與氫氧化鈉合成：A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl。此法合成的鋁膠含量低，透明無(wú)沉淀，目前廣泛用于制備人用生物制品，認(rèn)為佐劑效果良好，注射部位無(wú)硬結(jié)反應(yīng)。,配制時(shí)注意事項(xiàng)：,①氫氧化鋁具有較強(qiáng)的吸附力，所以，制膠過(guò)程中一般用軟化水或去離子水洗滌。②氫氧化鋁膠為兩性化合物，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)失去膠態(tài)。故要掌握好化合時(shí)的pH值。③貯存鋁膠應(yīng)放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，并嚴(yán)密封蓋，貯放

14、期不超過(guò)3個(gè)月。④鋁膠室溫保存，以免破壞膠態(tài)。,2．明礬（Alum）,有鉀明礬（KAl（SO4）2·12H2O）和銨明礬（AlNH2（SO4）2·12H2O）兩種。作為佐劑用于生物制品的主要是鉀明礬（即硫酸鋁鉀）。制造時(shí)，先將滅活菌液調(diào)至pH 8.0土0.1，選精制明礬制成10％溶液，高壓滅菌后，冷至25℃以下備用。按菌液量加入明礬溶液1～2％，充分振蕩，然后沉淀。佐劑作用與氫氧化鋁膠近似，但該法較簡(jiǎn)便，應(yīng)用

15、較廣，如破傷風(fēng)明礬沉淀類毒素和氣腫疽明礬滅活疫苗等。在美國(guó)只有明礬可在人體中應(yīng)用。,3．磷酸三鈣,在疫苗中加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，使在疫苗中化合成磷酸三鈣，吸附抗原后沉淀，所制出的幾種疫苗免疫效果良好。此法簡(jiǎn)便，質(zhì)量穩(wěn)定。鋁鹽類佐劑成本低廉，使用方便，安全性較好，已被廣泛用于獸用疫苗，乙肝、白喉等重組疫苗的佐劑。,缺點(diǎn)：,①輕度局部反應(yīng)，可形成肉芽腫，個(gè)別形成局部無(wú)菌性膿腫；②鋁膠疫苗怕凍，凍后鋁膠易變性；③有可能對(duì)人、畜神經(jīng)系

16、統(tǒng)有影響；④主要激活Th2免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。而誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答作用不明顯。只適用于以抗體為主要保護(hù)性免疫的疾病的疫苗，如白喉、破傷風(fēng)、乙肝、麻疹等。,（二）油乳佐劑,指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑，如弗氏佐劑。該類佐劑主要在抗原尋的過(guò)程中起作用，使抗原在注射部位保持穩(wěn)定，為抗原在淋巴系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)提供載體，增加單核細(xì)胞的形成和積聚。油乳劑疫苗的免疫效力高低，直接與乳化作用的好壞和乳劑成分的質(zhì)量等有關(guān)。

17、一種好的乳劑疫苗應(yīng)是油包水（水/油或W/O）或水包油（油/水或O/W）型，粘度低，顆粒均勻，穩(wěn)定性良好，呈乳白色。,1．乳劑的概念,“乳劑”是將一種溶液或干粉分散成細(xì)小的微粒，混懸于另一不相溶的液體中所成的分散體系。被分散的物質(zhì)稱為分散相（內(nèi)相），承受分散相的液體稱連續(xù)相（外相），兩相間的界面活性物質(zhì)稱為乳化劑。當(dāng)以水為分散相，以加有乳化劑的油為連續(xù)相時(shí)，制成的乳劑為W/O型，反之為O/W型。,W/O型、O/W型乳劑比較,制成什么樣的

18、乳劑型，與乳化劑及乳化方法密切相關(guān)。通常W/O型乳劑較粘稠，在機(jī)體內(nèi)不易分散，佐劑活性較好，為生物制品所采用的主要?jiǎng)┬?；O/W型乳劑較稀薄，注入機(jī)體后易于分散，但其佐劑活性很低，生物制品一般不采用這種劑型。,2．乳化劑,（1）乳化劑的種類天然乳化劑：來(lái)自動(dòng)植物，如阿拉伯膠、海藻酸鈉、蛋黃以及煉乳等。人工合成乳化劑，再分為離子型和非離子型。,離子型乳化劑,陰離子型：如堿肥皂、月桂酸鈉、十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鋁等，多用于乳化一般生物

19、制劑；陽(yáng)離子型：陽(yáng)離子類乳化劑有氯化苯甲烴銨、溴化十六烷三甲基和氯化十六烷銨代吡啶等，用于制備一般的水包油生物制劑。,非離子型乳化劑,多數(shù)是多元醇或聚合多元醇的脂肪酸脂類或醚類物質(zhì)，如月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和單油酸脂等。它們具有一定的親水性和親油性基團(tuán)，為制造醫(yī)藥或化妝品的乳化劑。制備注射用油乳劑滅活疫苗，最適用的乳化劑有去水山梨醇單油酸酯（其中，司本-80和Arlacel-A是同類產(chǎn)品）、聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯（商品名吐溫

20、-80）和硬脂酸鋁等。,（2）乳化劑的選擇,通常可根據(jù)用途，依據(jù)乳化劑的HLB值（親水親油平衡值）進(jìn)行選擇。乳化劑的HLB值與其在水中的溶解度相關(guān)；親油性的在水中溶解度小，HLB值低，易形成油包水型油乳劑。HLB值為4～6的乳化劑適用于制造W/O型油乳劑；常用的司本-80，HLB值為4.3，在水中溶解度低，不易在水中分散，溶于多種有機(jī)溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定，易形成W/O型油乳劑；親水性強(qiáng)的在水中溶解度大，HLB值高，容易形成水包油型油乳劑；

21、 HLB值在8～18的乳化劑適用于O/W型油乳劑。吐溫-80，其HLB值為15.0，易溶于水，易形成O/W型油乳劑。,3．白油佐劑,制苗用的白油應(yīng)無(wú)多環(huán)芳烴化合物、粘度低、無(wú)色、無(wú)味和無(wú)毒性。Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4是國(guó)內(nèi)外常用的制苗用白油。我國(guó)目前選用杭州煉油廠的7號(hào)或10號(hào)白油和北京石油化工科學(xué)研究院的合成白油，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)色無(wú)味，50℃運(yùn)動(dòng)粘度7m2／s左右，紫外吸收值（250～350

22、nm）＜0.1％，紫外消光系數(shù)＜12×108；單環(huán)芳烴與雙環(huán)芳烴含量低于0.5％，無(wú)多環(huán)芳烴；小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，觀察60d，表現(xiàn)正常。,4．乳劑配方與乳化方法,使用不同乳化劑和不同的配合比例及乳化方法，決定了制備乳劑的性狀和穩(wěn)定性。疫苗生產(chǎn)中主要有兩種基本方法。（1）劑在水中法：此法將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成O/W乳劑。若欲得W/O型，可繼續(xù)加入油，直到發(fā)生變型

23、。該法通常用勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到較好的乳劑。,（2）劑在油中法：,此法將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，繼續(xù)加入至變型。該法制成的乳劑，一般均勻顆粒直徑在0.5µm左右，比較穩(wěn)定。,免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用的佐劑,其配方按容量計(jì)為：礦物油（白油）75%~85％， 乳化劑15％~25%，混合后經(jīng)除菌過(guò)濾而成為弗氏不完全佐劑（FIA）；如向其中

24、加入0.5mg／m1死結(jié)核桿菌即為弗氏完全佐劑（FCA）。 使用時(shí)，將含抗原的水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻的乳劑。 也可用9份油和1份司本-80混合后加2％吐溫-80和1％~2%硬脂酸鋁，經(jīng)高壓滅菌后備用，注射前將配好的油佐劑與抗原水相1：1混合，強(qiáng)力振搖，可配制成性狀良好的乳劑疫苗。,副作用,弗氏佐劑具有高度佐劑活性，因而應(yīng)用廣泛。但因副作用強(qiáng)烈而限制其應(yīng)用。很少用于動(dòng)物免疫。

25、①油通過(guò)肌膜層造成組織損傷，局部形成結(jié)節(jié)和無(wú)菌性膿腫。②加入了結(jié)核菌素，能使PPD試驗(yàn)陽(yáng)性。③可能致癌；④過(guò)于粘稠，難以注射。,大量生產(chǎn),可將94％白油與6％司本-80混合后加1%~2％硬脂酸鋁，滅菌后即為油相；將抗原液加2％~4%吐溫-80為水相。乳化時(shí)，將油相與水相按3：1~2：1比例配制，先緩速混合，再通過(guò)膠體磨充分乳化，可獲得穩(wěn)定的油包水乳劑苗。雙相乳劑疫苗：將粘稠的W/O乳劑疫苗，再加2％吐溫-80生理鹽水，通過(guò)攪拌

26、或膠體磨乳化，可制成雙相乳劑疫苗（水-油-水乳劑或稱多型乳劑Multiple emulsion adjuvant）。優(yōu)點(diǎn)是：粘稠度低、在注射部位易分散、局部反應(yīng)輕微及佐劑效應(yīng)良好等。,5．油乳劑檢驗(yàn),生產(chǎn)實(shí)際中以粘度測(cè)定和穩(wěn)定性測(cè)定為主。 （1）粘度測(cè)定：最簡(jiǎn)易的方法是取內(nèi)口直徑為1.2mm的吸管，在室溫下吸滿lml乳劑，垂直放出0.4ml所需時(shí)間作為粘度單位，以0.4ml 2～6S為合格，不得多于10～15S，否則注射時(shí)就比

27、較困難。也可用Saybolt粘度計(jì)。（2）乳劑穩(wěn)定性測(cè)定：①加速老化法：疫苗于37℃貯存10～30d不破乳。②離心加速分層法：在一個(gè)半徑為10cm的離心器中裝油乳劑，3 000rpm離心15min不分層，相當(dāng)于保存1年以上不破乳。,（三）蜂膠佐劑,1．蜂膠的理化特性與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蜂膠（Propolis）是蜜蜂采自柳樹(shù)、楊樹(shù)、栗樹(shù)和其它植物幼芽分泌的樹(shù)脂，并混入蜜蜂上顎腺分泌物，以及蜂蠟、花粉及其它一些有機(jī)與無(wú)機(jī)物的一種天然物質(zhì)，含有多種

28、黃酮類、酸類、醇類、酚類、脂類、烯烴和萜類等化合物及多種氨基酸、酶、多糖、脂肪酸、維生素及化學(xué)元素，是一種優(yōu)良的天然藥物。,3．蜂膠的佐劑作用,蜂膠具有廣泛的生物活性和藥理作用。具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和促進(jìn)組織再生等作用。蜂膠具有良好的免疫增強(qiáng)作用。它能保持抗原特性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫力。,4．蜂膠佐劑疫苗制備方法,（1）蜂膠的處理：用市售蜂膠，放4℃以下

29、低溫貯存，用前在4～8℃下粉碎，過(guò)篩，按1：4（W/V）加95％的乙醇，室溫浸泡24～48h，冷卻，過(guò)濾或離心取上清，即得透明栗色純凈蜂膠浸液。除去干渣計(jì)算出浸液中含蜂膠量，浸液4℃以下保存?zhèn)溆谩?（2）蜂膠佐劑疫苗的制備,（以禽霍亂蜂膠疫苗為例）：將純凈培養(yǎng)的雞多殺性巴氏桿菌液，經(jīng)甲醛滅活后，加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，迅即成為乳濁狀，即為蜂膠佐劑疫苗。,四、細(xì)胞因子類佐劑,1979年第2屆國(guó)際淋巴因子

30、會(huì)議命名第1個(gè)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）在機(jī)體免疫系統(tǒng)活動(dòng)過(guò)程中，有許多種體液性免疫分子和細(xì)胞因子參與。前者如免疫球蛋白、補(bǔ)體和胸腺肽類。后者作為免疫活性細(xì)胞間相互作用的介質(zhì)和強(qiáng)有力的蛋白性調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、組織修復(fù)、組織移植反應(yīng)和造血。,（一）細(xì)胞因子的概念與分類,細(xì)胞因子（cytokine）是機(jī)體的各種細(xì)胞在其生命周期中所釋放的具有不同生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，是免疫細(xì)胞間相互作用

31、的調(diào)節(jié)信號(hào)。該類物質(zhì)相互誘生，相互影響，構(gòu)成一個(gè)巨大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)（cytokine network）系統(tǒng)，各種細(xì)胞借助自己所釋放的細(xì)胞因子完成各自的功能，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。,分類,一類為經(jīng)典的細(xì)胞因子，包括淋巴毒素（LT）、腫瘤壞死因子（TNF）、和干擾素（INF）等； 另一類為對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)作用的因子，其代表為白細(xì)胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF），可以促進(jìn)和抑制免疫應(yīng)答。 絕大多數(shù)的細(xì)胞

32、因子的分子量小于25KD，分子量最低者如IL-8僅8KD。 多數(shù)細(xì)胞因子以單體形式存在，少數(shù)以雙體形式發(fā)揮生物學(xué)作用。,（二）細(xì)胞因子的作用特點(diǎn),1．多效性：①免疫調(diào)節(jié)作用的多樣性：如IL-6除參與B細(xì)胞的分化、增值調(diào)節(jié)、抗體形成外，還對(duì)骨髓造血干細(xì)胞定向分化起重要作用，引起炎癥反應(yīng)及較強(qiáng)的抗病毒活性；②作用方式的非特異性：由特異性抗原或非特異性因子誘生的細(xì)胞因子，均以非特異性方式起作用，既不與抗原發(fā)生反應(yīng)，也不表現(xiàn)抗原特

33、異性。,細(xì)胞因子的作用特點(diǎn),2．靶細(xì)胞的多樣性：細(xì)胞因子作用的靶細(xì)胞多種多樣，包括單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、多型核白細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。該特征是構(gòu)成機(jī)體復(fù)雜的細(xì)胞—細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)。3．多源性： 表現(xiàn)為一種細(xì)胞因子可由多種不同來(lái)源的細(xì)胞產(chǎn)生，如可產(chǎn)生IL-1的細(xì)胞有B細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞及巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、郎罕氏細(xì)胞和星形細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞； 一種免疫細(xì)胞可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。 T細(xì)胞可產(chǎn)

34、生IFN-γ、TNF及IL等細(xì)胞因子。,細(xì)胞因子的作用特點(diǎn),4．高效性：細(xì)胞因子的作用方式與內(nèi)分泌激素類似，有內(nèi)分泌（endocrine）、旁分泌（paracrine）及自分泌（autocrine）等幾種形式，因此又有免疫激素（immune hormone）之稱。細(xì)胞因子在機(jī)體內(nèi)的產(chǎn)量雖很低，但都表現(xiàn)極高的生物學(xué)活性，10-1～10-15M即可顯示明顯的生物學(xué)活性。5．快速反應(yīng)性：即對(duì)激發(fā)因素的迅速反應(yīng)。細(xì)胞因子是一種分泌型蛋白質(zhì)，當(dāng)

35、免疫細(xì)胞受到刺激后，迅速在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成，轉(zhuǎn)移到高爾基體內(nèi)糖基化，然后通過(guò)分泌顆粒不斷排出細(xì)胞外。它在細(xì)胞內(nèi)極少存儲(chǔ)，一旦刺激終結(jié)，即停止合成，并迅速降解。,（三）細(xì)胞因子的應(yīng)用,1．作為免疫佐劑，提高疫苗的免疫效果：有些疫苗特別是死苗和亞單位苗免疫效果往往不理想，而多種細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，是有效的免疫增強(qiáng)劑，可提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力，明顯提高疫苗的免疫效果。但細(xì)胞因子佐劑活性一般不如常規(guī)佐劑。,2．作為免疫治療劑，預(yù)防和治療某

36、些病原感染,用細(xì)胞因子處理未感染動(dòng)物，可以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能，起到免疫治療的作用。如TNF、IL-1、IL-6和IL-8等細(xì)胞因子均參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過(guò)程；許多細(xì)胞因子對(duì)外來(lái)致病微生物及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)都有抑制作用，在臨床上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。,3．通過(guò)基因重組，構(gòu)建新型基因工程疫苗：,將細(xì)胞因子基因插入一些基因缺失疫苗或活載體內(nèi)，并使之表達(dá)，可以克服一些疫苗在特定狀態(tài)下的安全問(wèn)題，從而獲得理想的疫苗。如把小鼠或人IL-2的cDNA與含

37、禽流感血凝素（HA）基因的痘病毒重組，獲得可以表達(dá)IL-2的重組痘病毒。裸鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-2的插入并不影響HA的表達(dá)水平及免疫原性，并且可以防止禽流感病毒對(duì)裸鼠的致死，說(shuō)明插入細(xì)胞因子可以大大提高活病毒載體的安全性。,（四）幾種重要的細(xì)胞因子,1．白細(xì)胞介素-1（IL-1）：又稱淋巴細(xì)胞活化因子，是由抗原-抗體復(fù)合物、ConA、PPD、LPS及MDP等誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和其它多種組織細(xì)胞活化后分泌產(chǎn)生的一類激素樣多肽。分

38、子量15～20kDa，在pH值4～12之間穩(wěn)定，60℃1h作用不被破壞，可被蛋白分解酶處理而失活，可抵抗神經(jīng)氨糖酸苷酶處理。,IL-1是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子,可作用于多種免疫活性細(xì)胞，并擴(kuò)大其功能，在抗感染免疫、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)（抗腫瘤免疫）及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡（免疫自穩(wěn)）中起著重要作用。目前，多種動(dòng)物的IL-1 cDNA已被克隆，如豬、牛和羊等，也已獲得重組IL-1；人的IL-1已工業(yè)化生產(chǎn)，正在進(jìn)行臨床治療試驗(yàn)，主要

39、用作免疫增強(qiáng)劑。在動(dòng)物醫(yī)學(xué)上，IL-1主要用作免疫佐劑，可提高抗體滴度，但它也有明顯的副作用，主要表現(xiàn)為發(fā)熱和拉稀等。,2．白細(xì)胞介素-2（IL-2）：,是T細(xì)胞在抗原或促有絲分裂原（如ConA）刺激下所分泌的一種淋巴因子，可引起T細(xì)胞增殖和維持T細(xì)胞在體外的持續(xù)生長(zhǎng)，故曾稱為T(mén)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（TCGF）。IL-2是一種糖蛋白，含133個(gè)氨基酸；分子量為15～35kDa，于70℃30min及pH值2～9范圍內(nèi)穩(wěn)定，無(wú)抗原特異性。具有

40、促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)或增強(qiáng)細(xì)胞毒性細(xì)胞的殺傷活性、協(xié)同刺激B細(xì)胞增值及分泌免疫球蛋白、增強(qiáng)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN和CSF、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2R、促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和增殖及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬殺傷能力等免疫生物學(xué)效應(yīng)。,,作用于多種免疫細(xì)胞，包括T、B淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等，對(duì)免疫應(yīng)答有廣泛的上調(diào)作用。IL-2是人和獸藥研究中研究最多的細(xì)胞因子，除作用于外周T細(xì)胞增殖及抑制T細(xì)胞凋亡外，可能具有刺激胸腺產(chǎn)生T細(xì)胞的作用，

41、從而為免疫重建起作用。,3．白細(xì)胞介素-4（IL-4）：,又稱為B細(xì)胞刺激因子（BSF-1），是由Th細(xì)胞經(jīng)抗原或絲裂原刺激后產(chǎn)生的一類重要的淋巴因子。為蛋白性質(zhì)的肽類，分子量15～20kDa，有2～3個(gè)糖基化部位，由140個(gè)氨基酸構(gòu)成。IL-4對(duì)多種細(xì)胞均有作用，是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分。IL-4主要刺激B細(xì)胞的分化增殖，它能上調(diào)MHCⅠ類抗原、人白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-Ⅰ的表達(dá)，在體外，可增加CTL細(xì)胞毒作用和刺激TIL的溶解

42、和擴(kuò)增。對(duì)T、B淋巴細(xì)胞分化和成熟具有潛在的佐劑活性。它能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和自身受體IL-4R，增強(qiáng)或抑制免疫球蛋白的合成，可能成為一種強(qiáng)有力的佐劑候選因子。,4．白細(xì)胞介素-6（IL-6）：,是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，除影響B(tài)細(xì)胞和T細(xì)胞的增生與分化外，還參與CTL分化及對(duì)顆粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用。,5．白細(xì)胞介素-12（IL-12）：,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一主要由B細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，與IL-2有協(xié)同作用，所以曾被稱為細(xì)胞

43、毒淋巴細(xì)胞成熟因子（CLMF）和天然殺傷細(xì)胞刺激因子（NKSF）。IL-12為糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）兩個(gè)亞單位構(gòu)成，兩個(gè)亞單位完全由不同的基因所編碼，只有結(jié)合為一個(gè)完整的分子時(shí)才能發(fā)揮生物學(xué)活性。IL-12與亞劑量的IL-2能協(xié)同誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）。,白細(xì)胞介素-12（IL-12）：,IL-12還能誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。IL-12活性高于IL-2和IFN

44、，在極低濃度時(shí)（1-30ppm）就有顯著活性，對(duì)滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲(chóng)抗原具有有效的佐劑活性。IL-12誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1應(yīng)答反應(yīng)尤為引人注目，是最強(qiáng)的NK細(xì)胞激活因子，也是迄今為止誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答最主要的細(xì)胞因子。在Th1免疫反應(yīng)的起始和抗原特異性CTL激活過(guò)程中起關(guān)鍵作用?？赏糜谥饕T導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的疫苗佐劑。,6．白細(xì)胞介素-18（IL-18）：,也稱為IFN-γ誘導(dǎo)因子，是新近發(fā)現(xiàn)的鼠和人的細(xì)胞因子，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因

45、子的產(chǎn)生，激活NK細(xì)胞，高效分泌IFN2γ，刺激T細(xì)胞增殖和增強(qiáng)CTL的活性，與IL-12產(chǎn)生協(xié)同作用等。,7．γ-干擾素（interferons-γ，IFN-γ）,是由致敏T細(xì)胞（Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞等）在活的或滅活的病毒等干擾素誘生劑和某些細(xì)胞因子作用下所產(chǎn)生的一類高活性多功能的糖蛋白，分子量20～25kDa，由144個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)8.6。它的分子量小，可以自由出入細(xì)胞，作用無(wú)特異性。 具有抗病毒、抗腫瘤、抑制細(xì)胞

46、分裂、免疫調(diào)節(jié)和免疫佐劑等多種免疫生物學(xué)活性。具有廣譜的抗病毒作用，使病毒增殖量減少，細(xì)胞損傷程度降低，其作用是抑制病毒的復(fù)制。還能增強(qiáng)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的活性.,作用,它促使宿主細(xì)胞阻止病毒生長(zhǎng)，細(xì)胞產(chǎn)生一種抗病毒的物質(zhì) 再阻止宿主細(xì)胞為病毒譯制病毒蛋白質(zhì) 阻止病毒增殖。IFN-γ的佐劑作用主要是誘導(dǎo)MHC-Ⅱ的表達(dá)。當(dāng)IFN-γ與抗原在同一位置同時(shí)使用時(shí)，佐劑效果最好。,,,,應(yīng)用,目前，我國(guó)已開(kāi)發(fā)研制成功豬白細(xì)

47、胞干擾素（swine interferon）。該制品系用雞新城疫病毒誘導(dǎo)健康豬白細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、分裝等工藝制成。用于防治豬流行性腹瀉，每頭每日肌肉注射一次，乳豬10，000單位，仔豬20，000單位；病重者每天可注射兩次，連續(xù)3～5d為一個(gè)療程。,豬用干擾素：,主要用于TGE、PED、RV感染，口蹄疫，豬瘟、蘭耳病、園環(huán)病毒感染，PR、SI，水皰病，細(xì)小病毒等防治，特別是與豬用轉(zhuǎn)移因子協(xié)同應(yīng)用，效果更佳。每40公斤體重肌

48、肉注射1毫升，每日1次，連用3天。重癥加量2-3倍。與豬用轉(zhuǎn)移因子聯(lián)合應(yīng)用，用滅菌用水或生理鹽水稀釋，分別肌注。,使用注意點(diǎn)及使用法：,1、在使用后96小時(shí)內(nèi)不要接種弱毒苗，可以同時(shí)使用滅活苗，但不要混合注射。2、用滅菌用水或生理鹽水稀釋，不能用酸堿性溶液或葡萄糖鹽水稀釋。3、妊娠母豬、哺乳母豬及仔豬使用安全。4、啟用后在規(guī)定時(shí)間內(nèi)一次用完，解凍溶化后不要再進(jìn)行冰凍，在4℃可存放3天。,應(yīng)用注意點(diǎn),5．治療病毒性腹瀉，同時(shí)肌注復(fù)方

49、穿心連或雙黃連或痢菌凈或氟哌酸等止瀉消炎的藥，每日1-2次，連用4天。并改飲電解質(zhì)多維或口服補(bǔ)液鹽7天。6．口蹄疫：配合轉(zhuǎn)移因子注射。同時(shí)配合肌注復(fù)方靈芝多糖注射液或復(fù)方黃芪多糖注射液，并與防止心肌炎的藥物，如天王大敗毒注射液或五毒康注射液聯(lián)合應(yīng)用。每日1-2次，連用3天。,7．其它病毒感染：,同時(shí)配合肌注復(fù)方靈芝多糖注射液或復(fù)方黃芪多糖注射液或復(fù)方柴胡注射液等抗病毒的藥物，每公斤體重肌肉注射0.1毫升，每日1次，連用3-4天。要配

50、合使用廣譜抗生素,如頭孢噻呋,替米考星,氟苯尼考,強(qiáng)力霉素、阿莫西林、磺胺類藥物。注射或飼料加藥。為增強(qiáng)療效，配合轉(zhuǎn)移因子，每100公斤體重肌肉注射1毫升，每日1次，連用3天。,二、CpG DNA,CpG DNA是含有非甲基化CpG（胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸）基序的脫氧核糖核酸DNA。CpG基序（CpG motif）是具有較強(qiáng)免疫活性的以非甲基化的CpG為基元構(gòu)成的回文序列，其堿基排列大多為5′--Pur Pur- CG- Pyr Py

51、r--3′，也稱為免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。,CpG DNA,在動(dòng)物體內(nèi)能誘生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，在誘導(dǎo)機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答及調(diào)控免疫應(yīng)答類型（Th1或Th2型）等方面發(fā)揮重要作用。激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；刺激B淋巴細(xì)胞增殖、分化及產(chǎn)生免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）；誘導(dǎo)分泌IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ等多種細(xì)胞因子；

52、誘導(dǎo)抗抗體誘生的細(xì)胞凋亡。,（一）CpG DNA的免疫學(xué)活性,1．對(duì)B淋巴細(xì)胞的作用 細(xì)菌DNA可直接激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，此過(guò)程為非T細(xì)胞依賴性和非抗原特異性。如大腸桿菌質(zhì)粒DNA和CpG-ODN可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分泌IL-6等細(xì)胞因子。2．對(duì)巨噬細(xì)胞的作用 CpG DNA通?？芍苯蛹せ罹奘杉?xì)胞，并促進(jìn)多種Th1類細(xì)胞因子的分泌，如IL-12、TNF-α、IFN-α和IFN-β等。如細(xì)菌DNA和CpG-ODN均

53、可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α mRNA。,CpG DNA的免疫學(xué)活性,3．對(duì)NK細(xì)胞的作用 CpG DNA不能直接活化NK細(xì)胞，但可通過(guò)輔助細(xì)胞刺激細(xì)胞因子（如IL-12、TNF-α、IFN-α/β）的釋放間接地作用于NK細(xì)胞。4．對(duì)淋巴細(xì)胞的作用 CpG DNA不能直接活化T淋巴細(xì)胞，但能夠在單核細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如IFN-γ）作用下間接激活T淋巴細(xì)胞。,（二）CpG DNA的佐劑效應(yīng)與應(yīng)用前景,由于Th1免

54、疫反應(yīng)在微生物感染中具有重要作用，因而研究新型可誘導(dǎo)Th1免疫、安全、無(wú)副作用的佐劑，無(wú)論對(duì)獸用疫苗還是醫(yī)用疫苗都至關(guān)重要。合成的CpG-ODN可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-12、NK細(xì)胞分泌IFN-γ。這些細(xì)胞因子能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，顯示了CpG-ODN作為佐劑的潛在價(jià)值。而且CpG-ODN與鋁鹽佐劑有協(xié)同刺激活性，既能誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫，又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和粘膜免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，CpG DNA對(duì)治療病毒感染、哮喘、過(guò)敏性疾

55、病及腫瘤均有良好的效果。,三、基因工程減毒素,基因工程減毒素是一類免疫佐劑的總稱。細(xì)菌細(xì)胞壁成分或毒素不但能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而且在和抗原一起使用時(shí)，具有明顯的佐劑效應(yīng)。由于這些成分為細(xì)菌細(xì)胞壁成分或毒素，因而具有較強(qiáng)的毒性。該類毒素（尤其蛋白毒素）通過(guò)脫毒后，這些物質(zhì)可以起到良好免疫佐劑的功效。目前，已證明經(jīng)過(guò)基因突變體外表達(dá)的霍亂毒素（CT）、大腸桿菌不耐熱毒素（LT）和破傷風(fēng)類毒素（TT）等沒(méi)有毒性，但具有很好的佐劑作用

56、。,（一）霍亂毒素（CT）,霍亂毒素(CT)是良好的粘膜免疫原。CT是由A和B兩個(gè)區(qū)構(gòu)成的蛋白。B區(qū)具有主要免疫學(xué)作用，內(nèi)含5種獨(dú)立的非共價(jià)連接的B亞單位（CTB），無(wú)毒性，可與細(xì)胞結(jié)合。A區(qū)是CT的生物學(xué)活性部分，具有酶活性。它能提高對(duì)多種口服天然抗原的局部粘膜免疫力。 CT作為粘膜免疫佐劑的主要缺點(diǎn)是其本身具有毒性，天然CT不能用于人類，但可以用于動(dòng)物。用戊二醛將仙臺(tái)病毒與CT結(jié)合，CT毒性降低1000倍，但仍有佐劑性質(zhì)。

57、,霍亂毒素（CT）,將CTB與流感病毒凝血素（HA）結(jié)合，免疫后發(fā)現(xiàn)，一個(gè)劑量的CTB-HA可產(chǎn)生高水平的IgA和IgG抗體，而兩個(gè)劑量的HA不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。而抗體水平與抵抗致死性攻毒有關(guān)。鏈球菌表面蛋白與CTB結(jié)合后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗體。如不與CTB結(jié)合，要產(chǎn)生相同水平的抗體，則需100倍的抗原。CT毒素A和B兩個(gè)亞單位的表達(dá)質(zhì)粒DNA作為佐劑與DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（如IFN-γ）和

58、Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（如IL-4），具有很強(qiáng)的佐劑作用。,大腸桿菌不耐熱毒素（LT）,大腸桿菌LT毒素有A和B兩個(gè)亞單位，有一定抗原性，但其毒性很強(qiáng)。通過(guò)基因工程點(diǎn)突變技術(shù)，使A亞單位上的一個(gè)氨基酸發(fā)生改變，表達(dá)的 則無(wú)毒性作用，但保留了其佐劑效應(yīng)。該表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部粘膜免疫反應(yīng)。利用基因突變技術(shù)，構(gòu)建的A和B兩個(gè)亞單位的表達(dá)質(zhì)粒DNA聯(lián)合應(yīng)用，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（IFN-γ）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（IL-4

59、）。而且，LT毒素表達(dá)質(zhì)粒作為佐劑，可協(xié)助DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，有望成為一種新型免疫增強(qiáng)劑。,破傷風(fēng)類毒素（TT）,研究表明，TT也具有很強(qiáng)的佐劑效應(yīng)，特別是適合于多糖或小分子肽半抗原免疫。這些抗原經(jīng)偶聯(lián)結(jié)合到TT后，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高水平的IgG抗體應(yīng)答。,四、其他新型免疫佐劑,（一）免疫刺激復(fù)合物（ISCOM）免疫刺激復(fù)合物（immunostimulating complex）是由抗原物質(zhì)與由皂樹(shù)皮提取的一種糖

60、苷Quil A和膽固醇按1：1：1混合后自發(fā)形成的一種具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡。ISCOM直徑40nm，每個(gè)ISCOM約含10～12分子的蛋白質(zhì)。ISCOM是一種全新的抗原遞呈系統(tǒng)，對(duì)機(jī)體有免疫增強(qiáng)作用，具有佐劑和抗原遞呈的兩重功效。應(yīng)用于多種細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)病的疫苗，具有產(chǎn)生“全面”免疫應(yīng)答的效力，可長(zhǎng)期增強(qiáng)特異性抗體應(yīng)答。另外，ISCOM能有效地通過(guò)粘膜給藥，從而可以用于抗呼吸道感染。目前，獸用ISCOM疫苗已在國(guó)外投放

61、市場(chǎng)。,1．ISCOMs的制備,目前，已有20多種病毒的親水脂蛋白(如外殼蛋白)以及若干種細(xì)菌和原生動(dòng)物的膜蛋白被用于制備ISCOMs。制備時(shí)，首先用Triton、Tween、鏈烷基-N-甲基葡萄糖胺（MEGA）和葡萄糖辛酸酯（OG）等中性去垢劑將微生物裂解成分散的組分，并在形成ISCOMs的同時(shí)除去去垢劑。其方法有離心法和透析法。,2．ISCOM的作用機(jī)理,ISCOM是一種具有較高免疫學(xué)價(jià)值的新的抗原遞呈系統(tǒng)，其對(duì)輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒

62、T細(xì)胞和B細(xì)胞都有活化作用,在抗原遞呈、抗原尋的和免疫調(diào)節(jié)的過(guò)程中都有作用，增強(qiáng)APC活性。ISCOM可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)大多數(shù)抗原的體液免疫和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，調(diào)節(jié)MHCⅡ類抗原表達(dá)，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗非感染性抗原的MHCⅠ類限制的CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞；,ISCOMs的作用機(jī)理,ISCOM作為吞噬性抗原，可直接通過(guò)MHCⅠ分子處理并提呈給T細(xì)胞，也可通過(guò)皂素與膜結(jié)構(gòu)相互鰲合到達(dá)胞質(zhì)。誘導(dǎo)特異性抗體及亞型產(chǎn)生，增強(qiáng)CD8+CTL應(yīng)答，提高M(jìn)HCⅠ

63、分子在抗原提呈細(xì)胞的表達(dá)，誘導(dǎo)IL-1，IL-2及γ-IFN分泌，具有黏膜免疫活性。可激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，也可刺激體液免疫。還能克服母源抗體的封閉作用，通過(guò)黏膜途徑提呈抗原。是目前誘導(dǎo)CTL反應(yīng)最強(qiáng)的免疫刺激物。,（二）脂質(zhì)體佐劑,脂質(zhì)體（liposomes）是人工合成的具有單層或多層單位膜樣結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)小囊，由一個(gè)或多個(gè)類似細(xì)胞單位膜的類脂雙分子包裹水相介質(zhì)所組成，具有佐劑兼載體效應(yīng)。其作用方式主要是在抗原尋的中起作用。脂質(zhì)體的

64、結(jié)構(gòu)有利于將抗原遞呈給抗原處理細(xì)胞或其它免疫活性細(xì)胞。吞噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)體并破壞其膜結(jié)構(gòu)，釋放抗原并形成免疫復(fù)合物，有利于維持長(zhǎng)時(shí)期的高效價(jià)抗體及產(chǎn)生免疫記憶。脂質(zhì)體在宿主體內(nèi)可以生物降解，本身無(wú)毒性，并且能降低抗原的毒性，無(wú)局部注射反應(yīng)。脂質(zhì)體與弗氏佐劑或氫氧化鋁膠混合使用，效果更佳。目前，脂質(zhì)體和ISCOM被認(rèn)為是制備亞單位疫苗的理想載體和免疫佐劑。,（三）MF59佐劑,MF59佐劑由4.3％的角鯊?fù)椤?.5％的吐溫-80和0.5％

65、Span85組成。副反應(yīng)輕微，是除鋁鹽外，目前僅有的被批準(zhǔn)作為人用的免疫佐劑。在抗原中加入MF59佐劑的疫苗有很多種，如猿猴和人愛(ài)滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、皰疹病毒和瘧疾原蟲(chóng)抗原等，制成的疫苗常為O／W型。MF59不但可以刺激體液免疫，還可以激發(fā)細(xì)胞免疫。已進(jìn)行了廣泛的實(shí)驗(yàn)，人數(shù)超過(guò)8000，當(dāng)和HAS-2合用的1/2期臨床試驗(yàn)中，產(chǎn)生的抗體量與使用鋁佐劑量相同，也同樣有較強(qiáng)的輔助T細(xì)胞應(yīng)答。,（四）生物降解微球（mic

66、rosphere）,用微球囊括抗原的可控制釋放系統(tǒng)，注射一針可以解決全程免疫問(wèn)題。最成功和研究最多的抗原載體系統(tǒng)是聚脂類微球，可用于包裹激素、細(xì)胞因子、病毒顆粒及質(zhì)粒DNA等活性物質(zhì)。微球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)：一種是貯存型（微囊），在聚合物形成的囊腔中包有抗原物質(zhì)。二是實(shí)體型（微球）抗原均勻分布于聚合物內(nèi)。這種效果更好，便于抗原釋放的控制。抗原釋放有兩種方式：脈沖式和持續(xù)式。后一種方式 可在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放抗原。,問(wèn)題：,①微球材料需要用

67、有機(jī)金屬催化劑，殘留物的副作用。②微球制備時(shí)要用有機(jī)溶劑，也有殘留問(wèn)題；③蛋白類等抗原物質(zhì)，遇有機(jī)物會(huì)發(fā)生變性，聚集等反應(yīng)。影響免疫效果。④口服疫苗要消毒，所用的γ射線對(duì)抗原有損傷，對(duì)微球有降解作用。⑤保存微球要凍干，但如何避免抗原不受影響？,（五）微生物,1、卡介苗：是巨噬細(xì)胞的激活劑，同時(shí)還能刺激骨髓的多功能干細(xì)胞發(fā)育成為免疫活性細(xì)胞，從而明顯提高機(jī)體的免疫力。是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑。2、短小棒狀桿菌：經(jīng)加熱或甲醛滅活制

68、成。對(duì)機(jī)體毒性低，沒(méi)有嚴(yán)重的副作用。能非特異性刺激 淋巴樣組織增生，加強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，加速抗原處理，增加抗體IgG,、IgM的生成。,3.單磷腺脂A（monophosphoryl lipid A,MPL）,LPS 是來(lái)自革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，其佐劑效應(yīng)主要來(lái)自脂質(zhì)A。但由于其自身具有較大的毒性而無(wú)法作為人類疫苗的佐劑從一株沙門(mén)氏菌的細(xì)胞壁酸水解，從LPS中純化出脫毒的MPL產(chǎn)生的，是安全的免疫佐劑。能增強(qiáng)初次及再次免疫應(yīng)答