鼠傷寒沙門氏菌適配體的篩選及應(yīng)用研究.pdf

1、沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上最有重要意義的的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬于腸桿菌科，是一大群寄生于人類和動(dòng)物腸道內(nèi)，抗原構(gòu)造和生化反應(yīng)相類似的革蘭氏陰性桿菌的統(tǒng)稱。尤其以鼠傷寒沙門氏菌為代表的病原菌在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病預(yù)防等方面造成了巨大的威脅，對(duì)人體健康造成了很大危害。如何實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的快速檢測(cè)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到的一段短的單鏈DNA或RNA序列，它能夠

2、與相應(yīng)的靶標(biāo)分子如金屬離子、有機(jī)小分子藥物、蛋白質(zhì)乃至整個(gè)細(xì)胞進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性的結(jié)合。由于適配體幾乎可與每一個(gè)目標(biāo)分子進(jìn)行化學(xué)修飾，在生物分子的分析檢測(cè)和治療診斷等方面開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)新的局面。
　　石墨烯是一種由純碳原子緊密堆積成單層蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的新型二維納米材料。由于具有非常大的比表面積、優(yōu)良的導(dǎo)熱性和導(dǎo)電性、使得石墨烯在諸多領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用。氧化石墨烯是石墨烯的一種重要衍生物，表面大量存在的含氧基團(tuán)能夠增加其親和性及水溶

3、性。近年來(lái)，通過(guò)利用氧化石墨烯良好的生物相容性、高的熒光猝滅效率以及大的比表面積等優(yōu)點(diǎn)，相繼開(kāi)發(fā)了各種熒光生物傳感器。
　　本論文以鼠傷寒沙門氏菌特異性識(shí)別、靈敏檢測(cè)這一熱點(diǎn)問(wèn)題為切入點(diǎn)，主要開(kāi)展了以下兩個(gè)方面的研究工作:
　　一、SELEX篩選鼠傷寒沙門氏菌適配體方法的建立及適配體克隆、測(cè)序、鑒定及分析
　　以鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）為靶標(biāo)，利用體外細(xì)胞SELEX篩選技術(shù)，構(gòu)建了全長(zhǎng)為78個(gè)堿基，

4、中間含35個(gè)堿基隨機(jī)序列的單鏈核苷酸文庫(kù)，通過(guò)11輪反復(fù)常規(guī)篩選以及以腸炎、豬霍亂、甲型副傷寒和亞利桑那沙門氏菌為靶標(biāo)的4輪消減篩選，初步篩選到一組能特異性結(jié)合S.typhimurium的核酸適配體群。對(duì)最后一輪篩選得到的核酸適配體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，獲得了39條適配體序列。隨后對(duì)它們進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬分析，最終獲得了6條對(duì)S.typhimurium親和力高、特異性好的序列。利用熒光分析法對(duì)其親和力進(jìn)行測(cè)定，

5、Kd值均為0～100nM，其中Apt6的親和力最高，Kd值僅為30±4nM。隨后通過(guò)選擇特異性實(shí)驗(yàn)分析表明，適配體與S.typhimurium的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性且對(duì)同種屬的沙門氏菌不會(huì)有交叉結(jié)合。
　　二、構(gòu)建基于納米材料氧化石墨烯的熒光適配體傳感器
　　利用氧化石墨烯熒光猝滅劑的性質(zhì)和高特異性適配體，構(gòu)建了快速、簡(jiǎn)單、高靈敏的熒光適配體傳感器。在沒(méi)有靶標(biāo)S.typhimurium時(shí)，熒光標(biāo)記的適配體會(huì)自動(dòng)吸附到氧化石墨