鼠傷寒沙門菌L型的體外膽汁誘導(dǎo)及豬膽囊鼠傷寒沙門菌L型的檢測(cè)研究.pdf

1、目的：(1)了解膽汁對(duì)鼠傷寒沙門菌形成 L型的影響，建立鼠傷寒沙門菌L型的檢測(cè)方法。(2)了解豬膽囊攜帶鼠傷寒沙門菌L型的情況，探討膽囊攜帶鼠傷寒沙門菌L型的檢測(cè)方法。
　　方法:(1)將鼠傷寒沙門菌接種于豬膽汁內(nèi)，37℃需氧培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1h~60d不同時(shí)間段取誘導(dǎo)物進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)與鑒定。(2)同時(shí)取誘導(dǎo)物經(jīng)濾菌器濾過(guò)后接種于PG液進(jìn)行細(xì)菌L型的非高滲分離培養(yǎng)，分離細(xì)菌L型的純培養(yǎng)物。觀察細(xì)菌L型的形態(tài)，培養(yǎng)特性，革蘭

2、染色，細(xì)胞壁染色，糖發(fā)酵試驗(yàn)和血清學(xué)反應(yīng)。(3)用檢測(cè)沙門菌屬特異性基因invA和鼠傷寒沙門菌特異性基因STM4495的二重PCR技術(shù)，對(duì)細(xì)菌L型進(jìn)行檢測(cè)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。(4)在貴陽(yáng)市某屠宰場(chǎng)，采集284份豬膽囊標(biāo)本（膽囊組織142份和膽汁142份），采用常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行鼠傷寒沙門菌的分離培養(yǎng)和鑒定。(5)同時(shí)采用非高滲分離培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)菌 L型的分離培養(yǎng)，并用二重PCR檢測(cè)細(xì)菌L型分離株的invA和STM4495基因用于

3、鼠傷寒沙門菌L型的鑒定。將部分PCR陽(yáng)性產(chǎn)物片段進(jìn)行測(cè)序分析。
　　結(jié)果：(1)采用常規(guī)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)法從培養(yǎng)1h~60d的誘導(dǎo)物均可分離出細(xì)菌型，經(jīng)鑒定為鼠傷寒沙門菌。(2)同時(shí)經(jīng)非高滲分離培養(yǎng)檢出細(xì)菌L型。細(xì)菌L型呈圓球形或卵圓形，在血培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和LEM平板上不能生長(zhǎng)，革蘭染色、細(xì)胞壁染色和血清學(xué)試驗(yàn)均呈陰性，而糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果無(wú)法判斷。(3)二重PCR檢測(cè)細(xì)菌L型invA和STM4495基因可見與鼠傷寒沙門菌細(xì)菌

4、型一致的284bp和915bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。將兩者擴(kuò)增產(chǎn)物序列經(jīng)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的鼠傷寒沙門菌的一致性分別為100％和99%。(4)采用常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法，從284份膽囊標(biāo)本中，45份膽汁和104份膽囊組織檢出細(xì)菌，陽(yáng)性率為52.46%（149/284）。經(jīng)革蘭染色和生化鑒定，檢出細(xì)菌17個(gè)種屬、共200株，包括革蘭陰性菌184株，革蘭陽(yáng)性菌16株。革蘭陰性菌中檢出率最高是大腸埃希菌（32.75%,93/284）

5、，其他還包括氣單胞菌屬、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、成團(tuán)泛菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、遲鈍愛德華菌、假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、沙門菌屬、普通變形桿菌、巴斯德菌屬、肺炎克雷伯菌、異型枸櫞酸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌。沙門菌經(jīng)血清學(xué)鑒定為4株科特布斯沙門菌和4株倫敦沙門菌。革蘭陽(yáng)性菌均為鏈球菌屬（5.63%,16/284），以牛鏈球菌（81.25%,13/16）為主，余下為溫和鏈球菌。(5)采用非高滲分離培養(yǎng)法，90份膽汁和67份膽囊組織檢出細(xì)菌 L型，陽(yáng)性

6、率為55.28%（157/284）。經(jīng)二重PCR檢測(cè)，9份膽囊標(biāo)本（3份膽汁和6份膽囊組織）檢出沙門菌 L型，陽(yáng)性率3.17%（9/284），其中4份檢出鼠傷寒沙門菌 L型，5份檢出其他沙門菌L型。在9份沙門菌L型陽(yáng)性的標(biāo)本中，5份膽囊標(biāo)本（3份膽汁和2份膽囊組織）常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)呈陰性，但非高滲分離培養(yǎng)檢出2株鼠傷寒沙門L型和3株其他沙門L型。將部分invA和STM4495基因PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)與 GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中

7、鼠傷寒沙門菌的一致性均為99%。
　　結(jié)論：(1)鼠傷寒沙門菌在豬膽汁的作用下可發(fā)生細(xì)胞壁缺陷變異，成為L(zhǎng)型;(2)常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法不能用于鼠傷寒沙門菌穩(wěn)定 L型的分離培養(yǎng)與鑒定;(3)采用二重PCR技術(shù)檢測(cè)invA和STM4495基因，可鑒定鼠傷寒沙門菌的穩(wěn)定L型;(4)經(jīng)常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬膽囊可攜帶沙門菌和多種其他細(xì)菌，主要為革蘭陰性細(xì)菌，以大腸埃希菌的檢出率最高;(5)膽囊內(nèi)的鼠傷寒沙門菌L型，可采用非高滲分離培養(yǎng)法進(jìn)