沙門氏菌鞭毛蛋白B亞單位對不同IBDV免疫原免疫效果的影響.pdf

1、沙門氏菌鞭毛蛋白是構(gòu)成菌體鞭毛的單體蛋白，它不僅是細(xì)菌運(yùn)動和黏附的重要組成原件，也是天然Toll樣受體5(Toll-like receptor，TLR)的激動劑，能夠與TLR5結(jié)合激活MyD88信號途徑，引起IL-8等細(xì)胞因子分泌增多，增強(qiáng)免疫細(xì)胞分化增殖等效應(yīng)。雖然其本身具有沙門氏菌H抗原表位區(qū)域，卻不影響其佐劑作用的發(fā)揮，甚至可作為自身佐劑增強(qiáng)鞭毛的抗原性，因此，自1998年其佐劑作用被發(fā)現(xiàn)以來，一直是疫苗免疫增強(qiáng)劑的研究熱點(diǎn)，多項

2、研究顯示鞭毛蛋白能夠增強(qiáng)原核和真核表達(dá)蛋白抗原的抗原性，通過對天然免疫因子的調(diào)節(jié)增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答。干酪乳桿菌是安全級微生物(generally regarded as safe，GRAS)的益生菌，因其菌體成分和分泌物能夠明顯促進(jìn)黏膜和體液免疫，亦是疫苗佐劑候選者。
　　本研究利用重組鞭毛蛋白的免疫增強(qiáng)作用，通過以傳染性法氏囊病毒(IBDV)為抗原模型，探討了鞭毛蛋白對不同形式疫苗的免疫增強(qiáng)作用，結(jié)合干酪乳桿菌外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)無

3、毒素殘留、菌體及分泌成分具有益生作用的優(yōu)勢，以期獲得純化步驟簡單、易于生產(chǎn)的重組鞭毛蛋白作為疫苗免疫佐劑的候選者。利用PCR方法以鼠傷寒沙門氏菌菌體為模板獲得鞭毛蛋白B亞單位基因(FliB)，堿基序列經(jīng)對比與GenBank上已公布序列NC_003197.1完全一致。有應(yīng)用重疊延伸PCR(SOE-PCR)方法去掉FliB的高變區(qū)（171 aa～407aa），只保留氨基端和羧基端的保守序列，并插入柔性肽序列和酶切位點(diǎn)，獲得截短的鞭毛蛋白Fl

4、iBc，建立能夠便捷插入不同抗原的免疫增強(qiáng)劑基因模型。將FliB和FliBc基因連接乳酸菌載體pPG-2載體構(gòu)建重組干酪乳桿菌pPG-2-FliB/L.casei393和pPG-2-FliBc/L.casei393，誘導(dǎo)表達(dá)后獲得分子量分別為53 kD和35 kD的分泌型重組蛋白，在體外檢測其對人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2的TLR5刺激活性，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)IL-8表達(dá)量明顯升高，說明表達(dá)的重組蛋白FliB和FliBc在體外具有生物活性，

5、并且在培養(yǎng)條件相同情況下，單位體積內(nèi)pPG-2-FliBc/L.casei393培養(yǎng)上清中蛋白的TLR5刺激活性強(qiáng)于pPG-2-FliB/L.casei393。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艦榱藱z驗截短后的FliBc表達(dá)的蛋白對VP2抗原是否有增強(qiáng)免疫的作用，將IBDV保護(hù)性抗原VP2基因插入重組質(zhì)粒pProHTa-FliBc中，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出VP2-FliBc融合蛋白，并與其他兩種形式蛋白（單純表達(dá)的VP2蛋白，分別表達(dá)

6、的重組蛋白VP2和FliBc機(jī)械混合）分別加入弗氏佐劑制備出亞單位疫苗模型，免疫SPF雛雞后檢測各項指標(biāo)，探討構(gòu)建的FliBc是否能夠增強(qiáng)插入抗原引起的免疫反應(yīng)，以及融合和混合與抗原配合使用的效果。檢測免疫雞血清中IgY效價，嵌合蛋白VP2-FliBc組明顯顯著高于VP2+FliBc混合組和VP2組，MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖能力也明顯高于VP2組，攻毒保護(hù)率較對照組也有所上升。證明FliBc與VP2抗原蛋白融合后免疫發(fā)揮了明顯的免疫增

7、強(qiáng)作用，也進(jìn)一步驗證前人的結(jié)論:FliBc與抗原融合表達(dá)免疫效果強(qiáng)于與抗原機(jī)械混合，因為FliBc在與抗原連接時能夠更好的提呈抗原從而增強(qiáng)其特異性免疫應(yīng)答。
　?、茷樘剿鞅廾鞍着c活毒疫苗配合使用的免疫效果，本試驗選用IBDV商品化弱毒疫苗（D78株）作為抗原模型，選用肌注(im)和滴鼻(in)兩種方式免疫，分別與總蛋白含量相同的重組菌pPG-2/L.casei393、pPG-2-FIiB/L.casei393和pPG-2-Fli

8、Bc/L.casei393上清共同免疫7日齡SPF雛雞，只免疫一次。每周采血直至56日齡，檢測免疫后血清中IBDV特異性IgY效價，結(jié)果顯示兩種途徑pPG-2-FliBc/L.casei393上清組均具有最高效價，并且在49日齡免疫后SPF雞用IBDV超強(qiáng)毒株(vvIBDV)進(jìn)行攻毒，計算免疫保護(hù)率也明顯高于對照組。pPG-2-FliB/L.casei393組也顯示一定免疫增強(qiáng)作用，但效果不及截短的FliBc上清組。橫向比較肌注免疫途徑

9、與滴鼻免疫途徑，肌注方式的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度均高于滴鼻組，但檢測淚液和腸道粘液中的分泌型IgA(sIgA)水平，in組顯著高于im組，說明鞭毛蛋白在黏膜途徑免疫中具有夠增強(qiáng)局部免疫的功能。檢測免疫后血清中和抗體效價，im組整體水平高于in，最高中和效價達(dá)1∶100以上;相同免疫途徑組內(nèi)比較pPG-2-FliBc/L.casei393組顯著高于對照組，而pPG-2-FliB/L.casei393組與對照組差異不顯著。
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10、iBc作為IBDV VP2基因乳酸菌活載體疫苗免疫增強(qiáng)劑的評價:將VP2-FliBc基因與pPG-2連接轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌L.casei393，用Western-blotting方法檢測重組菌體和培養(yǎng)上清，均表達(dá)與預(yù)期相符的分子量約為76 kD的重組蛋白。將誘導(dǎo)后菌體培養(yǎng)至1010CFU/mL， pPG-2-VP2-FliBc/L.casei393和本實(shí)驗室構(gòu)建好的pPG-2-VP2/L.casei393，以及對照組pPG-2/L.case

11、i393分別經(jīng)口服途徑免疫SPF雛雞，并間隔10 d加強(qiáng)免疫兩次，檢測血清IgY特異性抗體效價，pPG-2-VP2-FliBc/L.casei393組高于pPG-2-VP2/L.casei393組;并且脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)和攻毒后保護(hù)率也均高于pPG-2-VP2/L.casei393組。說明在IBDV VP2干酪乳桿菌活載體基因疫苗中插入FliBc基因，能夠增強(qiáng)動物的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有免疫增強(qiáng)活性。
　　⑷建立了表達(dá)沙門氏菌全

12、長鞭毛蛋白FliB和截短鞭毛蛋白FliBc的E.coli和干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)并正確表達(dá)了兩種蛋白，通過L.casei393表達(dá)的兩種重組蛋白體外活性比較，顯示截短的FliBc的TLR5刺激活性強(qiáng)于FliB。同時建立三種形式IBDV疫苗模型:VP2亞單位疫苗、商品IBDV弱毒疫苗和VP2基因的乳酸菌活載體疫苗，將FliBc分別以蛋白和基因融合表達(dá)形式與三者配合使用，檢測血清IgY、黏膜IgA及免疫保護(hù)試驗評價免疫效果，說明FliBc無論在