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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
鞭毛蛋白(flagellin)是組成細(xì)菌運(yùn)動(dòng)器官鞭毛的基本蛋白結(jié)構(gòu)。由于細(xì)菌種屬的不同,鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)也不同,但是其都擁有相似的結(jié)構(gòu)域,其D1結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守,可以被TLR5所識(shí)別。鞭毛蛋白在參與細(xì)菌的致病機(jī)理和機(jī)體對(duì)其免疫應(yīng)答中都有重要作用。
自然殺傷(NK)細(xì)胞是一種固有免疫細(xì)胞,除了經(jīng)典的免疫監(jiān)視,免疫防御作用外,它也能分泌多種的細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。研究NK細(xì)胞的活性變化,一個(gè)重要的指標(biāo)就是NK細(xì)胞的
2、細(xì)胞毒性作用,NK92細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)以及小鼠NK細(xì)胞對(duì)Yac-1細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)NK細(xì)胞胞毒作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。
嗜堿粒細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)數(shù)量最少的白細(xì)胞,但是最近的研究表明,嗜堿粒細(xì)胞并非可有可無的細(xì)胞,該細(xì)胞在過敏疾病中的作用越來越受到研究者的注意。有證據(jù)顯示,在初始T細(xì)胞(naive T cell)向Th2細(xì)胞的分化過程中,嗜堿粒細(xì)胞可以提供一部分的關(guān)鍵細(xì)胞因子—IL-4,而IL-4的分泌變化也是考量嗜堿粒細(xì)胞細(xì)
3、胞活性的標(biāo)志之一。
目的:
?。?)轉(zhuǎn)化Flic-PET30a至BL21細(xì)菌,刺激BL21表達(dá)來自于傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白并純化獲取該蛋白。
(2)研究該鞭毛蛋白對(duì)BMDC,BMMφ,NK細(xì)胞和BM-basophils的功能影響。
方法:
?。?)采用分子克隆經(jīng)典方法轉(zhuǎn)化Flic-PET30a質(zhì)粒到BL21細(xì)菌,擴(kuò)增并用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)Flic蛋白。
?。?)依據(jù)“蛋白HIS標(biāo)簽”
4、與鎳柱有高親和力,并且可以被特定咪唑濃度緩沖液洗脫的特點(diǎn)純化獲得較高純度的Flic蛋白。
?。?)用Flic蛋白刺激小鼠BMDC和BMMφ來測(cè)定其分泌TNF-α分泌水平是否增加。
?。?)用Flic蛋白刺激NK92,小鼠脾來源NK細(xì)胞,檢測(cè)其是否對(duì)NK細(xì)胞胞毒作用有影響。
?。?)用Flic蛋白刺激小鼠BM-basophils,檢測(cè)其IL-4分泌水平是否增加。
結(jié)果:
?。?)表達(dá)并純化獲取了來
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