鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備.pdf

1、沙門氏菌是一種人畜共患病病原菌，可導(dǎo)致食物中毒，對(duì)人類健康造成很大的威脅。本論文通過擴(kuò)增沙門氏菌fliC基因，構(gòu)建pET28a-fliC重組子，實(shí)現(xiàn)沙門氏菌fliC基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將純化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，獲得多克隆抗體，并對(duì)抗血清的效價(jià)和特異性進(jìn)行檢測(cè)，為后續(xù)利用該多抗建立沙門氏菌ELISA快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。本文分三部分進(jìn)行研究闡述:
　　 1、鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC的克隆及其在E.co

2、li中的表達(dá)
　　 通過PCR方法從鼠傷寒沙門氏菌中擴(kuò)增出fliC基因，連接到原核表達(dá)載體pET28a(+)上，構(gòu)建pET-28a(+)-fliC重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，通過酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證后加入IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物與預(yù)期的目的基因大小相吻合;構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白分子量為55KD，與預(yù)期目標(biāo)蛋白大小相吻合。

3、
　　 2、鼠傷寒沙門氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白的純化及鑒定
　　 用鎳金屬離子親和層析對(duì)鞭毛融合蛋白進(jìn)行純化，然后通過SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度和分子量，并通過BCA法和Western-blot分別檢測(cè)蛋白濃度和蛋白的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Ni-NTA純化的蛋白純度較高，分子量與目的蛋白相符，經(jīng)Western-blot分析，表達(dá)產(chǎn)物可與抗His-tag單抗在55KD處產(chǎn)生特異性結(jié)合，表明表達(dá)產(chǎn)物中確實(shí)含有His-tag標(biāo)簽，