傷寒沙門菌鞭毛基因表達(dá)相變換機(jī)制研究.pdf

1、食品是人類生存和發(fā)展的基本需求之一，它提供人體生長發(fā)育、維持生命以及進(jìn)行各種活動所需的能量和營養(yǎng)物質(zhì)。食品與人們的生活息息相關(guān)，因而食品的安全性對人類健康就顯得至關(guān)重要。食品中微生物污染是食品安全最主要的問題之一，如沙門菌對食品的污染而引起的食物中毒，即使在西方發(fā)達(dá)國家也有明顯上升的趨勢。沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的一個重要菌屬，為革蘭氏陰性，需氧或兼性厭氧，絕大部分有鞭毛，具有運(yùn)動

2、性的桿狀細(xì)菌，是人類研究最為廣泛和深入的食源性病原微生物。沙門菌主要棲息在動物的腸道，隨糞便排出后就可污染其他周圍環(huán)境，污染的食品被人或動物食用后，再經(jīng)過腸道、糞便繼續(xù)循環(huán)，可通過食品或飼料的國際貿(mào)易而擴(kuò)大，這是沙門菌在世界范圍廣泛分布的主要原因。
　　 鞭毛(flagella)是細(xì)菌的動力裝置，也是沙門菌的一種重要的毒性因子。鞭毛基因的表達(dá)調(diào)節(jié)在沙門菌的感染過程中，尤其是在侵襲過程中具有極其重要的作用，因此鞭毛缺損變異使沙門菌

3、的致病力大為降低。沙門菌的鞭毛具有極為豐富的多態(tài)性，通過血清學(xué)檢查，已有近100種不同鞭毛抗原被發(fā)現(xiàn)，命名為a至z和zl至zN。沙門菌鞭毛抗原的多態(tài)性與基因的水平轉(zhuǎn)移和局部變異相關(guān)。據(jù)菌體和鞭毛抗原特性，已有2200多種沙門菌血清型被發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)的血清型，如鼠傷寒沙門菌(S.Typhimurium)有兩相不同的鞭毛素編碼基因，分別位于染色體不同的部位，稱之為Ⅱ相菌株。常以fliC和fljB分別表示Ⅰ相和Ⅱ相鞭毛素編碼基因。在沙門菌入侵宿

4、主的過程中，會激活宿主的免疫系統(tǒng)使機(jī)體產(chǎn)生抗體來應(yīng)付細(xì)菌的入侵，大部分沙門菌則可以通過改變抗原的表達(dá)來應(yīng)對這種抗體應(yīng)激。這種在鞭毛抗體存在的條件下，兩相沙門菌等可自行變換鞭毛抗原表達(dá)的特性稱之為相變換(phase variation)，這可能是細(xì)菌逃避宿主免疫監(jiān)控的機(jī)制之一。
　　 傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是沙門菌屬中一種重要的人類腸道致病菌，其通過污染食物

5、進(jìn)入消化道，克服胃酸、高滲腸液及腸道正常菌群的防御作用，在空腸遠(yuǎn)端侵入腸上皮M細(xì)胞，并能進(jìn)一步在局部腸系膜淋巴組織和吞噬細(xì)胞中存活和增殖，再經(jīng)淋巴液和血液系統(tǒng)進(jìn)入肝脾等組織，造成全身系統(tǒng)性感染-“傷寒”(typhoid fever)。傷寒沙門菌從環(huán)境至人體空腸的遠(yuǎn)端，需經(jīng)一系列調(diào)節(jié)，如增加莢膜(Vi)抗原表達(dá)以克服劇烈胃酸環(huán)境影響，進(jìn)入腸道后減少莢膜抗原的表達(dá)，增加鞭毛抗原與一些編碼基因位于沙門菌致病島Ⅰ(Salmonella Path

6、ogenic Island1，SPI-1)的侵襲因子的表達(dá)，以協(xié)助細(xì)菌粘附于腸上皮M細(xì)胞，進(jìn)而侵入腸上皮組織。因此，在感染過程中傷寒沙門菌應(yīng)對各種不同環(huán)境應(yīng)激的自身調(diào)節(jié)極為重要。
　　 目的：
　　 長期以來人們都認(rèn)為傷寒沙門菌為單相菌株，即只有Ⅰ相鞭毛素編碼基因fliC，其相應(yīng)的抗原為d抗原或j抗原(d抗原編碼基因的中央可變區(qū)缺損了261bp)。1981年Guinee首次在從印度尼西亞分離獲得的傷寒沙門菌菌株中發(fā)現(xiàn)一種

7、新的鞭毛抗原，命名為z66抗原。2004年我們首次成功地克隆了z66抗原的編碼基因fljB：z66，fljB：z66下游525-bp的ORF與鼠傷寒沙門菌等Ⅱ相沙門菌的fljA有較高的相似性，為fljA樣基因，最近我們也證實(shí)了該基因是一相鞭毛素基因fliC的抑制基因。在抗H：z66的鞭毛抗體存在條件下體外培養(yǎng)，z66抗原陽性傷寒沙門菌能改變鞭毛抗原的表達(dá)，但這種變化與鼠傷寒沙門菌等的相變換不同，為單向不可逆變化，即只能從z66抗原表達(dá)轉(zhuǎn)

8、變?yōu)閐或i抗原的表達(dá)。最近有研究表明，z66抗原的編碼基因位于一罕見的線性質(zhì)粒中，而且這種單向相變換是與線性質(zhì)粒缺失變異有關(guān)，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。另外，我們也首次發(fā)現(xiàn)有兩株不同來源(日本和印度)的z66+傷寒沙門菌野生株有不同的鞭毛相變換表象，即在抗體誘導(dǎo)后其線性質(zhì)?？砂l(fā)生部分和完全缺失的兩種不同現(xiàn)象。已有研究表明，鞭毛可作為鼠傷寒沙門菌的外部特殊感受器，感受環(huán)境濕度和溫度，發(fā)揮對自身鞭毛基因的表達(dá)調(diào)節(jié)作用。據(jù)此我們推測，鞭毛與相應(yīng)的抗

9、體結(jié)合后，可以啟動胞內(nèi)一系列基因表達(dá)調(diào)節(jié)，最終通過某些關(guān)鍵基因的表達(dá)改變，致線性質(zhì)粒的缺失變異而實(shí)現(xiàn)單向性鞭毛表達(dá)的相變換。本文的目的是為了揭示鞭毛作為細(xì)菌外部特殊感受器介導(dǎo)胞內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控特性，并通過比較抗體誘導(dǎo)的菌株之間的基因組差異，深入探究z66+傷寒沙門菌鞭毛單向相變換確切的分子機(jī)制，為原核生物鞭毛可發(fā)揮特殊感受器的功能提供全新認(rèn)識。
　　 方法：
　　 (1)傷寒沙門菌鞭毛素基因fljB：z66的克隆表達(dá)及其

10、多克隆抗體的制備根據(jù)fljB：z66基因兩端序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從H：z66陽性傷寒沙門菌基因組DNA中得到鞭毛素基因fljB：z66，將該基因克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)上并在大腸桿菌JM109中進(jìn)行表達(dá)；fljB：z66的表達(dá)產(chǎn)物FljB-his6經(jīng)Ni柱純化后作為抗原免疫兔以制備其多克隆抗體。
　　 (2)抗體誘導(dǎo)傷寒沙門菌鞭毛相變換及基因組結(jié)構(gòu)分析利用含抗H：z66抗體的半固體LB平板誘導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)室保存的兩株

11、不同來源的H：z66陽性的傷寒沙門菌，然后通過脈沖場凝膠電泳和Southern Blot等技術(shù)分析相變換前后細(xì)菌染色體結(jié)構(gòu)的變化。同時，通過提取H：z66陽性的傷寒沙門菌GIFU10007及其相變株j菌的線性質(zhì)粒，通過對其進(jìn)行DNA測序和酶切鑒定，分析相變換前后細(xì)菌線性質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)變化。
　　 (3)抗體脅迫下傷寒沙門菌鞭毛介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控分析傷寒沙門菌GIFU10007在兔抗H：z66多克隆抗體誘導(dǎo)30分鐘后，利用傷寒沙門菌全

12、基因組芯片分析技術(shù)分析其與正常對照血清誘導(dǎo)30分鐘后的傷寒沙門菌GIFU10007的基因表達(dá)譜的差異。用同樣的方法分析傷寒沙門菌GIFU10007的缺陷株△fljB：z66在兔抗H：z66多克隆抗體誘導(dǎo)30分鐘后的基因表達(dá)譜的變化作為無鞭毛的對照組實(shí)驗(yàn)。選擇部分表達(dá)差異顯著的有代表性的基因，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，驗(yàn)證基因芯片的分析結(jié)果。
　　 (4)兩株具有不同相變換表象野生傷寒沙門菌(GIFU10007

13、和Ind-8)的全基因組結(jié)構(gòu)比較分析提取兩株鞭毛相變換表象不同H：z66陽性傷寒沙門菌野生株的線性質(zhì)粒，通過PCR技術(shù)分析比較這兩株菌各自的線性質(zhì)粒的DNA序列差異；提取兩株H：z66陽性傷寒沙門菌的基因組DNA，通過Solexa法測定這兩株傷寒沙門菌的全基因組DNA序列，分析比較它們的差異基因，以分析傷寒沙門菌鞭毛相變換的關(guān)健因子。
　　 結(jié)果：
　　 (1)經(jīng)PCR和酶切鑒定以及DNA測序證實(shí)，傷寒沙門菌鞭毛素基因f

14、ljB：z66被成功導(dǎo)入表達(dá)載體pET-28a(+)，并在大腸桿菌JM109中獲得了高效表達(dá)，以此表達(dá)的蛋白作為抗原成功制備了兔抗z66的多克隆抗體。
　　 (2)本實(shí)驗(yàn)室保存的兩株不同來源的H：z66陽性的傷寒沙門菌的基因fljB：z66均位于一罕見的線性質(zhì)粒中，在兔抗H：z66多克隆抗體的誘導(dǎo)下均成功發(fā)生了鞭毛抗原從表達(dá)z66至表達(dá)d/j的單向相變換，這種單向相變換是由于傷寒沙門菌在抗體誘導(dǎo)下線性質(zhì)粒缺失了含fljBA的2.

15、6 kb末端區(qū)域或線性質(zhì)粒的全部丟失所導(dǎo)致的。
　　 (3)傷寒沙門菌GIFU10007在抗H：z66抗體誘導(dǎo)30min后，187個基因的表達(dá)發(fā)生了3倍以上的明顯變化，其中有122個基因表達(dá)上調(diào)，包括構(gòu)成核糖體的多種蛋白質(zhì)基因和參與轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的多種因子等；同時也有65個基因在抗體誘導(dǎo)后表達(dá)下調(diào)，其中包括多種代謝酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因等。實(shí)時熒光定量RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了基因芯片實(shí)驗(yàn)的部分結(jié)果與基因表達(dá)譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致

16、，表明在鞭毛抗體應(yīng)激下，傷寒沙門菌的鞭毛確實(shí)可以作為外部的感受器，介導(dǎo)大量的基因表達(dá)調(diào)節(jié)。
　　 (4)兩株在抗H：z66多克隆抗體的誘導(dǎo)下具有不同相變換表象的傷寒沙門菌其fljB：z66所在的線性質(zhì)粒DNA序列沒有明顯的差異。這兩株細(xì)菌的全基因組測序分析表明，共有628個基因具有顯著的差異，其中185個基因在傷寒沙門菌GIFU10007中沒有，只存在于H：z66陽性傷寒沙門菌Ind-8野生株中，其余有差異的基因其DNA序列差異

17、都在40％以上。在這185個基因中，包括了多種參與DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因，以及編碼多種代謝酶和功能未知的蛋白基因。
　　 結(jié)論：
　　 (1)本文成功克隆了傷寒沙門菌鞭毛素基因fljB：z66，表達(dá)了其編碼蛋白Z66，并制備了兔抗Z66的多克隆抗體。
　　 (2)利用制備的兔抗H：z66的多克隆抗體，成功誘導(dǎo)了兩株不同來源的z66+傷寒沙門菌的鞭毛單向性相變換，同時還表明了兩株細(xì)菌的fljB

18、：z66基因位于一罕見的線性質(zhì)粒上，在抗H：z66的抗體的誘導(dǎo)下，線性質(zhì)粒會完全丟失和僅丟失含fljBA的2.6 kb末端區(qū)域不同的變化；
　　 (3)揭示了H：z66陽性傷寒沙門菌的鞭毛可以作為一特殊感受器來介導(dǎo)胞內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控；
　　 (4)發(fā)現(xiàn)了兩株鞭毛相變換表象不同的H：z66陽性傷寒沙門菌野生株，它們具有628個差異顯著的基因，其中某些基因可能是鞭毛相變換作用的關(guān)健因子，為進(jìn)一步深入研究傷寒沙門菌線性質(zhì)粒介導(dǎo)