PCV-2山東株感染性克隆的構(gòu)建及ORF2基因的原核表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porein circoviru，PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動(dòng)物病毒之一，分為兩型：PCV-1和PCV-2，二者都屬于圓環(huán)病毒屬。PCV-2被認(rèn)為是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)的病原，而PMWS給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此PCV-2成為研究的熱點(diǎn)。本研究從具有PMWS臨床及病理變化的淋巴結(jié)中克隆得到PCV-2的全基因組序列

2、，構(gòu)建含有首尾相連的兩個(gè)PCV-2全基因序列的雙拷貝感染性克??；同時(shí)，本研究還克隆了PCV-2ORF2基因，并在E.coli中成功表達(dá)。 本研究共分為三個(gè)部分： 第一部分：豬圓環(huán)病毒2型山東株全基因組的克隆與序列分析 根據(jù)GenBank中己發(fā)表的PCV-2全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用PCR方法直接從病料中擴(kuò)增出PCV-2的全基因組序列，將擴(kuò)增片段克隆于pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明PCV-2基因組全長(zhǎng)

3、為1767bp，命名SDZQ-1株。應(yīng)用DNAstar序列分析軟件分析結(jié)果表明，本研究的PCV-2序列與國(guó)內(nèi)外其它研究中的PCV-2序列密切相關(guān)，核苷酸序列同源性達(dá)95.1％-99.1％，其中ORF1和ORF2所編碼的氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外其它研究中的PCV-2序列比較，同源性也很高，分別為96.2％-99.7％和91.0％-98.7％。 第二部分豬圓環(huán)病毒2型雙拷貝傳染性克隆的構(gòu)建 根據(jù)測(cè)得的SDZQ-1株全基因序列重新設(shè)

4、計(jì)兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增出PCV-2全基因序列，將兩個(gè)SDZQ-1的全基因組序列正向串聯(lián)連接入PUC19載體質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了PCV-2雙拷貝質(zhì)粒。體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，盲傳5代后，用PCR和間接免疫熒光方法檢測(cè)，結(jié)果構(gòu)建的PCV-2克隆具有感染性。 第三部分豬2型圓環(huán)病毒SDZQ-1株ORF2基因的原核表達(dá) 設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增PCV-2 SDZQ-1株長(zhǎng)580bp的ORF2序列，并將其克隆入原核表達(dá)載體pET-32a。經(jīng)