豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)及其在PCV2抗體檢測(cè)ELISA方法建立和單克隆抗體制備中的應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)近年來被認(rèn)為是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的致病因子。PMWS主要引起斷奶保育豬進(jìn)行性消瘦。自1991年在加拿大健康斷奶仔豬群中首次發(fā)現(xiàn)PMWS以來，世界上許多養(yǎng)豬國家和地區(qū)都報(bào)道了該病的發(fā)生和流行。本病主要臨床癥狀為消瘦、呼吸困難、淋巴結(jié)腫大、腹瀉、蒼白及黃疸。

2、 診斷PCV2最常用的血清學(xué)方法包括間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)。間接免疫熒光試驗(yàn)與免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員且繁瑣耗時(shí)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)克服了間接免疫熒光試驗(yàn)與免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)中人為因素造成的偏差，體現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)越性。最近用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)PCV2感染多見報(bào)道，其中用PCV2單克隆抗體建立的間接競(jìng)爭(zhēng)EL．ISA表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性。 本研究根據(jù)豬圓環(huán)病毒

3、2型(PCV2)南農(nóng)株的全基因組序列(DQ104422)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用PCR技術(shù)，從PCV2毒株中擴(kuò)增出不含核定位序列的ORF2基因，并克隆入pGEM-T easy載體中，根據(jù)藍(lán)白斑篩選及限制酶酶切分析得重組質(zhì)粒pGEM-ORF2。經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證正確后，將目的基因克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6P-1的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的下游，獲得重組質(zhì)粒pG：EX-ORF2。把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在37℃、IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)

4、行表達(dá)。通過對(duì)重組大腸桿菌的菌體裂解物的SDS．PAGE電泳分析及Western-blot鑒定，表明重組菌能正確表達(dá)GST-Cap融合蛋白。 利用原核表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型重組融合蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗體的間接ELISA方法。對(duì)ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇重組蛋白抗原的最適包被濃度為3gg/ml，最適包被條件為常溫(約25℃)1h加4℃過夜，待檢血清稀釋度為1：200。包被的重組蛋白不與豬瘟(HCV)

5、、豬偽狂犬病(PRV)、豬細(xì)小病毒病(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，建立的ELISA方法有良好的特異性。間接ELISA方法的建立為試劑盒的研制與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 以純化的融合蛋白(GST-Cap)作為免疫原，通過腹部皮下注射免疫BALB/c小鼠，末次加強(qiáng)免疫后3d無菌取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，進(jìn)行HAT選擇培養(yǎng)，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)篩選獲得了2株分泌抗PC

6、V2 Cap蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1D2和6D8，其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1：256、1：1024，小鼠腹水效價(jià)分別為1：8192、1：131072。ELISA結(jié)果顯示，1D2和6D8僅與表達(dá)的Cap蛋白反應(yīng)，而與空載體pGEX-6P-1表達(dá)的蛋白、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒不反應(yīng)。間接免疫熒光結(jié)果顯示，6D8能與PCV2發(fā)生熒光反應(yīng)，而不與PCVl發(fā)生交叉反應(yīng)，表明所獲得的6D8是PCV2型特異性的