豬戊型肝炎病毒ORF2基因的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、戊型肝炎(Hepatitis E)是一種由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的經(jīng)消化道傳播的人畜共患傳染病。主要通過糞-口方式傳播,在衛(wèi)生條件較差的地方,水污染是暴發(fā)流行的主要原因,在亞洲、非洲和美洲等發(fā)展中國(guó)家呈現(xiàn)大規(guī)模爆發(fā),發(fā)達(dá)國(guó)家主要以散發(fā)形式流行。該病在青少年中容易發(fā)展為暴發(fā)性肝炎,可以導(dǎo)致孕婦流產(chǎn),病死率高達(dá)21％。HEV是一種線性單股正鏈、無囊膜的RNA病毒。病毒基因組由3個(gè)開放閱讀框組成:ORF

2、1、ORF2和ORF3,ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,ORF2編碼核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白,ORF3編碼細(xì)胞骨架相關(guān)的磷蛋白。大量研究發(fā)現(xiàn)ORF2編碼產(chǎn)生的核衣殼蛋白包含大量的抗原決定簇,靠近C端的2／3部分存在的大量?jī)?yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位,還有多個(gè)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。ORF2編碼的衣殼蛋白三個(gè)線性結(jié)構(gòu)域,分別S結(jié)構(gòu)域、P1結(jié)構(gòu)域和P2結(jié)構(gòu)域。
　　 HEV分布廣泛,危害嚴(yán)重。HEV抗體廣泛存在于非人靈長(zhǎng)類、各種嚙齒類以及豬雞等家畜家禽中,

3、并在人和豬等動(dòng)物體內(nèi)均檢測(cè)到HEV核酸。因此,通過對(duì)豬源swCH189株HEV ORF2基因的分段原核表達(dá),獲得四個(gè)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白,不僅有助于了解S結(jié)構(gòu)域蛋白的自我組裝功能,P1結(jié)構(gòu)域維持衣殼蛋白穩(wěn)定性的機(jī)制,而且制備了5株針對(duì)P12蛋白的單克隆抗體,而且通過單克隆抗體的制備篩選P2結(jié)構(gòu)域的抗原表位?？梢詾榱私釮EV衣殼蛋白組裝機(jī)制,穩(wěn)定機(jī)制和不同結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系等提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),對(duì)于豬源HEV的診斷和建立一種特異性較高的ELISA

4、診斷試劑盒等具有重要意義。
　　 本研究首先采用RT-PCR方法獲得戊型肝炎病毒swCH189株ORF2全基因序列。根據(jù)ORF2蛋白線性結(jié)構(gòu)域的分布和生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)四對(duì)引物,分別從構(gòu)建的重組ORF2陽性質(zhì)粒擴(kuò)增S、P1、P2和P12四個(gè)基因片段,將得到的四個(gè)基因亞克隆到pET-32a(+)載體中,分別構(gòu)建融合表達(dá)載體pET-S、pET-P1、pET-P1和pET-P12。重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化合適的表達(dá)菌Rosetta(D

5、E3)或者BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,菌體裂解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果,得到截短表達(dá)蛋白His-S、His-P1、His-P2和His-P12,大小分別為41kDa、35kDa、45kDa和58 kDa,片段大小和預(yù)期分子量相符,主要以包涵體形式存在。采用Promege His標(biāo)簽蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化后。得到高純度的目的蛋白,可以直接用于免疫試驗(yàn)動(dòng)物或者單抗的制備。純化蛋白分組免疫兔子,可以獲得高滴度的抗戊肝

6、病毒結(jié)構(gòu)蛋白多克隆抗體。免疫兔子血清作為一抗對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blot鑒定其免疫原性結(jié)果說明:表達(dá)蛋白均與免疫兔子血清具有較強(qiáng)的反應(yīng)原性。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用純化的融合蛋白His-P12免疫實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行單克隆抗體的制備,細(xì)胞分泌上清進(jìn)行間接ELISA和Western Blot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)最終篩選出5株(1H3、3G11、4A7、3G12、4A2)為針對(duì)His-P12目的蛋白的雜交瘤細(xì)胞株,同時(shí)采用間接ELISA和West