豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物在ELISA建立和單克隆抗體制備中的應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的病原，它不但可以引起斷奶仔豬發(fā)生衰竭、死亡，還與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。這些疾病的廣泛流行嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)，給好多國家和地區(qū)帶來巨大的損失。PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各種病原的繼發(fā)感染，造成的間接損失難以估計(jì)。PCV2已經(jīng)成為嚴(yán)重阻礙

2、養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一。目前，還沒有一種可靠的、適于大規(guī)模診斷和檢測PCV2的方法，其原因在于PCV1在豬群中的感染比較普遍，且與PCV2的核苷酸同源性較高，存在抗原交叉現(xiàn)象，現(xiàn)有的檢測方法或者難以將其區(qū)分，或者不適合大規(guī)模的臨床樣本檢測與開展流行病學(xué)調(diào)查。PCV2特異性的抗原位點(diǎn)主要集中在ORF2區(qū)域。ELISA方法適用于大規(guī)模的臨床樣本檢測，若用PCV2 ORF2的表達(dá)產(chǎn)物建立ELISA檢測方法就能夠達(dá)到既區(qū)分PCV1和PCV2又

3、能夠進(jìn)行規(guī)?；瘷z測的目的。而對(duì)于疾病的防制最根本是要建立抗原檢測方法，用抗PCV2 ORF2蛋白的單抗建立檢測PCV2抗原的方法可以盡早檢出圓環(huán)病毒，從而可盡早防治。 本實(shí)驗(yàn)就是通過分子生物學(xué)手段將PCV2 ORF2進(jìn)行了體外表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了純化復(fù)性。以純化復(fù)性蛋白為免疫原分別進(jìn)行了多克隆抗體及單克隆抗體的制備工作。以期為綜合防制該病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本論文的實(shí)驗(yàn)由三部分構(gòu)成，一是克隆出PCV2的ORF2基因

4、，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，通過基因重組技術(shù)表達(dá)出ORF2基因，二是利用表達(dá)蛋白建立間接ELISA檢測方法，三是用表達(dá)的蛋白免疫新西蘭大白兔和Balb/c小鼠，制備抗PCV2 ORF2蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，用所建立的間接ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，以期獲得高效穩(wěn)定分泌抗PCV2 ORF2蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株。主要結(jié)果如下： 1．參照已發(fā)表的PCV2基因組序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增PCV2 ORF2基因的后部約580b

5、p片斷。與載體pET-32a Vector連接，轉(zhuǎn)化BL21-△E3細(xì)胞后挑取陽性克隆，經(jīng)酶切鑒定和測序驗(yàn)證后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析，表明ORF2基因均在大腸桿菌中得到了表達(dá)。其表達(dá)量約為菌體蛋白的30％。Western blot表明PCV2 ORF2表達(dá)產(chǎn)物分子量約為28ku。 2．將表達(dá)的PCV2 ORF2蛋白純化并復(fù)性，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測未見其他雜帶。純化后的蛋白按照墨克蛋白復(fù)性試劑盒說明書進(jìn)

6、行了復(fù)性。經(jīng)Western blot檢測表明，復(fù)性后的重組蛋白能被PCV2多克隆陽性血清所識(shí)別。具有良好的反應(yīng)原性。 3．純化復(fù)性的PCV2 ORF2蛋白作為包板抗原建立間接ELISA檢測方法。通過對(duì)抗原包被濃度、抗體稀釋度、二抗?jié)舛?、各步驟作用時(shí)間等的摸索，得出了重組抗原最適包被濃度為0.5mg/L，最適包被條件為4℃過夜，血清稀釋度為1：160，酶標(biāo)二抗工作濃度為1：7500，待檢血清和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間均為37℃45min，底物3

7、7℃顯色10min。阻斷試驗(yàn)表明建立的間接ELISA對(duì)PCV2抗體具有很好的特異性。板內(nèi)和板間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果為，同1份血清板內(nèi)各孔的變異系數(shù)均值為2.78％，板間同一份血清OD值變化也不大。表明本方法的重復(fù)性好。 4．用復(fù)性的PCV2 ORF2蛋白免疫了家兔和Balb/c小鼠，制各了高效價(jià)的多克隆抗體。ELISA方法檢測兔和小鼠抗PCV2 ORF2蛋白多克隆抗體的效價(jià)分別達(dá)到了1：12800及1：10<'7>。用復(fù)性的PCV2