豬2型圓環(huán)病毒感染性分子克隆構(gòu)建及其ORF1基因的表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科,是一種無(wú)囊膜的二十面體的單鏈環(huán)狀DNA病毒.該病毒分為兩種基因型,即PCV-1和PCV-2.前者出Tischer等1974年在PK-15(ATCC-CCL)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),沒(méi)有致病性;后者是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的重要病原.設(shè)計(jì)合成一對(duì)擴(kuò)增豬Ⅱ型圓環(huán)病毒(PCV-2)全基因組的特異性引物,從3份患斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(postweaning multisys

2、temic wasting syndrome,PMWS)的死亡仔豬病料中,PCR擴(kuò)增和克隆了3株P(guān)CV-2全基因組序列.將所測(cè)序列與已公布的PCV毒株序列進(jìn)行同源性比較,并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù).結(jié)果顯示,所測(cè)毒株間的核苷酸同源性為95.7﹪-99.4﹪,與其它毒株的同源性較高,達(dá)95.1﹪以上;ORF1的核苷酸同源性高達(dá)97.8﹪以上,氨基酸同源性大于98﹪;ORF2的核苷酸同源性較低,為90﹪-98﹪不等,推導(dǎo)的氨基酸序列同源性介于87

3、﹪-99.1﹪.進(jìn)化樹(shù)分析表明各分離毒株在進(jìn)化上存在地域上的相關(guān)性.將克隆到的PCV-2基因組環(huán)化后,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,盲傳3代.間接免疫熒光檢測(cè)表明,克隆到的青島(QD)毒株基因組具有感染性.將克隆到的PCV-2基因組SacⅡ酶切釋放,體外連接生成二聚體,然后插入pBluescript SK+載體,構(gòu)建PCV-2分子克隆pSK2PCVG,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,間接免疫熒光檢測(cè)表明,pSK2PCVG在體外具有感染性.

4、根據(jù)已測(cè)定的序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增和克隆到了ORF1基因的完整編碼區(qū)段,并測(cè)定了核苷酸序列.克隆的ORF1基因全長(zhǎng)945bp,編碼314個(gè)氨基酸.進(jìn)一步將此片段亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a和pGEX-KG中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,Western印跡檢測(cè)獲得了分子量分別為38kD和63kD的非融合蛋白和與谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)相融合的表達(dá)蛋白.該研究克隆了3株P(guān)CV-2的全基因組,并測(cè)定了序列,通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析