蠟梅親環(huán)素基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、親環(huán)素(Cyclophilins,CyPs)是親免素(immunophilin)家族的一員,在番茄、玉米、油菜、大白菜、水稻、擬南芥和豆類等植物中已經(jīng)分離并克隆得到親環(huán)素基因。它作為免疫抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporin A,CsA)的受體蛋白與CsA形成CyP-CsA復(fù)合物阻斷了T細(xì)胞信號(hào)傳遞從而產(chǎn)生免疫抑制作用。親環(huán)素具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性,能夠催化蛋白質(zhì)尤其是富含脯氨酸蛋白質(zhì)的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)。親環(huán)素在植物

2、中還參與葉綠體的光保護(hù)和氧化還原調(diào)節(jié),植物的生長(zhǎng)發(fā)育,并在植物脅迫應(yīng)答及抗病原體免疫等方面發(fā)揮重要作用。
　　 本研究從已經(jīng)構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫中克隆得到了一個(gè)蠟梅CYP基因,進(jìn)行序列特征、原核表達(dá)以及轉(zhuǎn)化煙草的分析,具體結(jié)果如下:1、蠟梅親環(huán)素基因的克隆以及分子特征分析。
　　 在已構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫及EST分析的基礎(chǔ)上,隨機(jī)克隆測(cè)序得到了一個(gè)蠟梅親環(huán)素基因,克隆的蠟梅親環(huán)素cDNA全長(zhǎng)為927bp,該基

3、因編碼164個(gè)氨基酸,理論分子量約18.26KD,命名為CpCYP(GenBank登錄號(hào):DW223084)。該基因編碼的蛋白與大豆、葡萄等氨基酸序列同源性達(dá)到90％以上,有9個(gè)PPIase活性位點(diǎn),屬于單結(jié)構(gòu)類親環(huán)素。CpCYP編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由23.17％的α螺旋、43.90％的隨機(jī)卷曲以及27.44％的延伸鏈構(gòu)成。該基因編碼的蛋白無信號(hào)肽,不存在跨膜結(jié)構(gòu),具有良好的親水性,有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)。
　　 2、CpCYP基因

4、原核表達(dá)載體構(gòu)建以及表達(dá)體系優(yōu)化。
　　 設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過克隆載體pMD19-T將CpCYP連接到pET-32a并上轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。獲得的重組蛋白以可溶性形式存在。從誘導(dǎo)溫度、IPTG終濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間三個(gè)方面優(yōu)化表達(dá)體系,溫度提高能夠提高可溶性蛋白的表達(dá)量,隨著誘導(dǎo)的時(shí)間增加,可溶性蛋白的表達(dá)量呈遞增趨勢(shì),在4h后表達(dá)量基本不再增

5、加。
　　 3、對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。
　　 設(shè)計(jì)帶有XbaⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)的引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增獲得帶有酶切位點(diǎn)的特異片段與pMD19-T連接,分別用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切pMD19-T/CpCYP和表達(dá)載體pCAMBIA2301,回收目的片段并連接,獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-CpCYP。利用凍融法,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404。利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草,獲得具有Km+抗性的煙草植株,通過GUS檢