蠟梅轉(zhuǎn)錄因子基因ANL2的克隆和功能探究.pdf

1、蠟梅（Chimonanthus praecoxL.），是蠟梅科蠟梅屬的一種觀賞性極強(qiáng)的樹(shù)種，素以于寒冬臘月傲雪盛放而名，花朵顏色淡雅，花香撲鼻，沁人心脾。在蠟梅的研究中，蠟梅品種分為素心蠟梅品種群、暈心蠟梅品種群和紅心蠟梅品種群，其中素心蠟梅花朵通體黃色，清新淡雅，而紅心蠟梅內(nèi)被片呈紫紅色，中被片和外被片呈淡黃色，總體色彩層次有致，觀賞性極高。在擬南芥中，ANL2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?cái)M南芥葉片和莖中花青素的分布，蠟質(zhì)的合成以及根部細(xì)胞發(fā)育。

2、r>　　本文對(duì)蠟梅ANL2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行探究，克隆到ANL2的全長(zhǎng)片段，構(gòu)建植株雙元表達(dá)載體pCAMB IA2300-CpANL，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染擬南芥野生型、擬南芥突變體和煙草，得到轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表型進(jìn)行研究和分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.篩選轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中的ANL2轉(zhuǎn)錄因子，克隆其全長(zhǎng)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括保守結(jié)構(gòu)域分析，系統(tǒng)進(jìn)化分析和蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)，命名為CpANL2。
　　2.提取素心蠟梅和紅心蠟梅不同花期

3、的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定CpANL2在不同蠟梅品種、不同花期和花朵不同部位的表達(dá)量差異。通過(guò)研究結(jié)果的分析，推測(cè)CpANL2可能調(diào)控類(lèi)黃酮代謝通徑中影響槲皮素合成的上游基因的表達(dá)，進(jìn)而影響花青素的合成。
　　3.構(gòu)建CpANL2-pCAMBIA2300植物雙元表達(dá)載體，通過(guò)熱激法將目的基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。采用花序浸染法浸染野生型擬南芥，獲得T1代陽(yáng)性植株6株，T2代陽(yáng)性植株40株，隨機(jī)選取24株

4、，提取DNA檢測(cè)，全部為陽(yáng)性植株。采用花序侵染法侵染突變體擬南芥，得到T1代植株30株，隨機(jī)選取23株，提取DNA檢測(cè)，得到陽(yáng)性植株21株。采用葉盤(pán)法浸染煙草，隨機(jī)選24株煙草抗性苗，提取DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)得到20株呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株。
　　4.野生型擬南芥超量表達(dá)獲得的陽(yáng)性植株，通過(guò)表型觀察，發(fā)現(xiàn)T1代植株葉片表面較野生型相比顏色深，莖干都呈現(xiàn)紫紅色，且有一株陽(yáng)性植株葉片和莖干都呈現(xiàn)紫紅色，T2代陽(yáng)性植株中葉柄和莖干都呈現(xiàn)紫紅