蠟梅CpNAC8轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及功能初步鑒定.pdf

1、蠟梅[Chimonanthus praecox(L.)Link]為蠟梅科蠟梅屬的落葉喬灌木植物，是我國(guó)特有的傳統(tǒng)名貴觀賞花木，作為冬季重要的園林花卉和鮮切花，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值，對(duì)于培育抗逆的蠟梅品種是一項(xiàng)非常重要的任務(wù)。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)特有的一類能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，應(yīng)答生物和非生物脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子，它能與植物體內(nèi)的順式作用元件發(fā)生特異結(jié)合，從而激活或抑制下游目標(biāo)基因的表達(dá)。目前對(duì)于NAC基因的研究主要集中在模式植

2、物中，而在非模式植物中非常有限，本研究將對(duì)蠟梅中NAC轉(zhuǎn)錄因子CpNAC8的功能進(jìn)行初步探索。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下
　　1.CpNAC8的克隆及分子特性
　　從實(shí)驗(yàn)室的蠟梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員的部分基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)RACE技術(shù)獲得其中一個(gè)NAC基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為CpNAC8。得到的基因全長(zhǎng)1583bp，含有1479bp的最大開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼492個(gè)氨基酸殘基。構(gòu)建CpNAC8系統(tǒng)進(jìn)

3、化樹(shù)，并將蠟梅CpNAC8編碼的蛋白與其它NAC蛋白進(jìn)行同源比對(duì)，表明CpNAC8屬于II/ONAC4亞家族，且與馬鈴薯的親緣關(guān)系較近。
　　2.CpNAC8基因在蠟梅中的表達(dá)特征分析
　　采取實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)CpNAC8基因在蠟梅不同組織，不同時(shí)期，不同脅迫處理（干旱、高鹽、高溫、低溫、ABA、GA）的表達(dá)特性進(jìn)行分析。表明CpNAC8基因在蠟梅的各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在成熟葉和雌蕊中表達(dá)量最高，推測(cè)該基因可能參

4、與植物葉的形態(tài)建成以及雌蕊的發(fā)育。CpNAC8基因在萌動(dòng)期表達(dá)量最高，盛開(kāi)期幾乎不表達(dá)。CpNAC8基因在干旱、高鹽、高溫、ABA、GA脅迫條件下都上調(diào)表達(dá)，但不同脅迫條件下，呈現(xiàn)最高表達(dá)量的時(shí)間點(diǎn)不同。結(jié)果推測(cè)該基因可能響應(yīng)干旱、高鹽、高溫脅迫，可能參與ABA、GA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　3.CpNAC8轉(zhuǎn)錄激活特性驗(yàn)證
　　構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGBKT7-CpNAC8-ORF、pGBKT7-CpNAC8-VP16，轉(zhuǎn)化酵母菌

5、株AH109，表明CpNAC8基因具有轉(zhuǎn)錄激活性，且是轉(zhuǎn)錄激活子。
　　4.CpNAC8基因轉(zhuǎn)擬南芥的表型研究
　　構(gòu)建植物超表達(dá)載體pCAMBIA1300-CpNAC8，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)篩選得到純合的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，選擇表達(dá)量高，中，稍弱的三個(gè)株系進(jìn)行表現(xiàn)觀察和脅迫處理。結(jié)果表明，將蠟梅CpNAC8基因?qū)胍吧蛿M南芥，不會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)造成不良影響；轉(zhuǎn)基因株系擬南芥種子比野生型擬南芥種子對(duì)NaCl的敏感性更強(qiáng)