蠟梅金屬硫蛋白基因的克隆、表達(dá)與功能分析.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類富含Cys能夠結(jié)合重金屬的低分子量蛋白質(zhì)，廣泛分布于生物界。近來對(duì)金屬硫蛋白的研究日益深入，越來越多的金屬硫蛋白基因被發(fā)現(xiàn)并克隆。很多研究表明，金屬硫蛋白可能具有清除自由基、重金屬解毒、抗衰老、抗輻射、修復(fù)組織損傷和調(diào)節(jié)微量元素平衡的功能。還可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞的增殖與凋亡密切相關(guān)。動(dòng)物金屬硫蛋白由于發(fā)現(xiàn)較早，目前已研究得較深入，而植物金屬硫蛋白發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚，進(jìn)展也相對(duì)緩

2、慢。本文從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫(kù)中克隆了一個(gè)金屬硫蛋白基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，并用His-Bind蛋白純化回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化回收，得到了蠟梅金屬硫蛋白，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為以后研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1.蠟梅金屬硫蛋白基因CpMT的克隆
　　 本文在構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)上，通過隨機(jī)克隆測(cè)序克隆得到了1個(gè)蠟梅金屬硫蛋白的cDNA，將其命名為CpMetallothionein

3、(CpMT)。CpMT cDNA全長(zhǎng)為1083 bp，基因內(nèi)部含有一個(gè)長(zhǎng)度為240 bp的可編碼79個(gè)氨基酸殘基的開放閱讀框(ORF)。
　　 2.CpMT基因編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)分析
　　 運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)CpMT基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)進(jìn)行了分析，最大ORF編碼的79個(gè)氨基酸分子量約為7765.95 D，等電點(diǎn)為4.67，共6個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在NCBI上進(jìn)行基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)其保守結(jié)構(gòu)域同MTs有部分相

4、似性。表明其編碼蛋白質(zhì)具有MT-like proteins結(jié)構(gòu)域，屬于MT-like proteins蛋白家族。
　　 3.CpMT基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與原核表達(dá)體系的優(yōu)化
　　 根據(jù)目的基因和載體特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切、連接和轉(zhuǎn)化等操作將蠟梅金屬硫蛋白基因和原核表達(dá)載體pET-32a片段連接，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體PET32-CpMT。并轉(zhuǎn)化到Origami2感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了融合蛋白，融合蛋白分子

5、量約為29kD。從誘導(dǎo)溫度、IPTG終濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間三個(gè)方面優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)體系，經(jīng)SDS-PAGE電泳確認(rèn)表達(dá)的融合蛋白以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在。
　　 4.CpMT基因功能初步分析
　　 首先進(jìn)行了轉(zhuǎn)化菌重金屬耐受性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌較對(duì)照菌有更好的重金屬耐受性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其功能，構(gòu)建了植物表達(dá)載體PC2301-CpMT，并轉(zhuǎn)化到煙草中，經(jīng)GUS染色檢測(cè)和PCR檢測(cè)，證明轉(zhuǎn)化成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)