茶樹ACS、ACO基因克隆與親環(huán)素基因的鑒定及其表達分析.pdf

1、乙烯是一種重要的植物激素,參與植物整個生理過程.ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)和ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid oxidase.ACO)是植物乙烯合成過程中的重要酶,對乙烯的合成具有重要的調(diào)控作用,所以這兩個基因的研究具有理論與實際意義. 在茶樹新梢cDNA文庫測序所獲得的EST基礎上,利

2、用RACE(Rapid Amplification cDNAEnds)、RT-PCR等技術,克隆得到編碼這兩個酶的全長基因序列,在NCBI上分別登錄為EF205149、DQ904328.其中ACS長1579 bp,編碼478個氨基酸,預測分子量約為53.7 KD,等電點8.039:ACO長1237 bp,編碼320個氨基酸殘基,預測分子量為36.2 KD,等電點5.41.以Neighbor-Joining法構建進化樹,發(fā)現(xiàn)ACS及ACO

3、都與柿樹中的同類基因同源性最高,親緣關系最近.這兩個基因的獲得為以后進一步研究其在茶樹抗逆中的作用打下一定的基礎. 根據(jù)所得到的茶樹ACS及ACO基因序列設計引物,利用β-actin作為陽性對照,取安吉白茶、6/8、杭州大葉、龍井長葉、藪北、龍井43和福鼎大白茶7個品種在經(jīng)歷高溫和低溫,以及龍井43在冬天不同時期樣品逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進行RT-PCR分析,結果發(fā)現(xiàn)ACS及ACO基因的表達量與品種的抗逆性強弱有一定程度的相關性;在不

4、同時期龍井43樣品中,ACS及ACO基因的表達也有類似的結果. 親環(huán)素廣泛存在于多種生物體內(nèi),在植物的發(fā)育和新陳代謝等生理過程中具有重要作用.通過對茶樹新梢cDNA文庫大量隨機測序,獲得了一個編碼親環(huán)素的全長基因,在GenBank登錄,登錄號為DQ904327.茶樹親環(huán)素基因cDNA全長949 bp,其中開放閱讀框全長495 bp,編碼蛋白質(zhì)含有164個氨基酸,分子量約為17.47 kD,等電點約為8.54,它具備5'端非編碼區(qū)

5、的"CAAT"標志及3'端非編碼區(qū)的"AATAAA"poly.A加尾信號.其推測的氨基酸序列經(jīng)與26條其他生物親環(huán)素蛋白氨基酸序列進行CL[JSTALW多序列聯(lián)配并以Neighbor-Joining法進行進化樹構建后,發(fā)現(xiàn)與水稻和小麥的相似性較高,達到85﹪以上.根據(jù)親環(huán)素基因開放閱讀框序列設計引物,構建了原核表達載體pET/Csin-Cyp,并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功誘導出了一個分子量為23 kD的親環(huán)素融合蛋白.這將便于后