蠟梅病程相關(guān)蛋白基因CpPR-4的克隆及功能初步分析.pdf

1、病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-relatcdprotein,PRs)是植物在受到病原體入侵或受到非生物脅迫時(shí)產(chǎn)生和積累的一類蛋白,它是植物自我防御機(jī)制中的可誘導(dǎo)組分。研究表明植物體內(nèi)病程相關(guān)蛋白的顯著提高,影響著植物防衛(wèi)反應(yīng),可以提高植物體的相關(guān)抗性。因此利用和開發(fā)病程相關(guān)蛋白,可成為一條提高植物自身抗性的有效途徑。目前發(fā)現(xiàn)的病程相關(guān)蛋白家族約有17個(gè),分別是PR-1到PR-17。
　　 本文在已有的基礎(chǔ)上,從蠟梅cD

2、NA文庫(kù)中克隆出一個(gè)蠟梅病程相關(guān)蛋白4基因即CpPR-4基因,首先對(duì)基因的編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及功能的初步預(yù)測(cè),隨后構(gòu)建CpPR-4基因的植物表達(dá)載體及原核表達(dá)載體,并對(duì)其功能進(jìn)一步的驗(yàn)證,主要研究結(jié)果如下:
　　 獲得了蠟梅病程相關(guān)蛋白4基因的全長(zhǎng)編碼區(qū),并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)蠟梅CpPR-4基因編碼蛋白的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分析,結(jié)果表明其編碼142個(gè)氨基酸,理論分子量約為15KD,預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.57,無(wú)內(nèi)含子的存在

3、,具2個(gè)磷酸化位點(diǎn),存在信號(hào)肽,CpPR-4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋(α-helix,26.76%),延伸鏈(extendedstrand,26.06%),隨機(jī)卷曲(randomcoil,33.10%)和少量β轉(zhuǎn)角(βturn,14.08%)構(gòu)成,在NCBI上對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)CpPR-4基因編碼的蛋白具有DPBB_1超家族的特征。
　　 構(gòu)建了蠟梅CpPR-4基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301g/CpPR-4,通過農(nóng)桿菌

4、介導(dǎo)將該植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到野生型煙草植株中,并獲得轉(zhuǎn)基因植株14株。通過煙草花葉病毒侵染試驗(yàn)和蛙眼病菌侵染試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)煙草花葉病毒無(wú)明顯抗性,而對(duì)蛙眼病病菌有一定抗性;低溫脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相較野生型煙草,CpPR-4基因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)低溫不利環(huán)境的抗性。
　　 構(gòu)建了目的基因的原核表達(dá)載體pET-32a/CpPR-4,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),經(jīng)條件優(yōu)化誘導(dǎo)獲得大小約36KD的目的融合蛋白