食蟹猴—豬異種體細(xì)胞核移植的研究.pdf

1、異種核移植可能成為保護(hù)高度瀕危動(dòng)物，建立治療性克隆非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型和核質(zhì)互作關(guān)系研究動(dòng)物模型的一種有效方法?？梢员苊馊祟愔委熜钥寺⊙芯恐械膫惱怼⒎珊团R床上的實(shí)驗(yàn)限制。本研究利用核移植技術(shù)，將食蟹猴耳部皮膚成纖維細(xì)胞融于去核豬卵母細(xì)胞中，經(jīng)融合和活化后，體外培養(yǎng)，并進(jìn)行了相關(guān)的研究。
　　 1.應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法從年齡4歲的雄性食蟹猴耳皮膚進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，成功建立了耳緣組織成纖維細(xì)胞系。單個(gè)細(xì)胞均為典型梭形細(xì)胞，抗波形蛋白免

2、疫熒光染色顯示為陽(yáng)性，抗角形蛋白免疫熒光染色為陰性，分離到的細(xì)胞為耳部成纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)分析了培養(yǎng)細(xì)胞的微管蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示培養(yǎng)細(xì)胞具有良好的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，從另一側(cè)面反映了培養(yǎng)條件比較適合于食蟹猴耳成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型，細(xì)胞生長(zhǎng)經(jīng)歷了潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期和停滯期，符合體外細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律。該成纖維細(xì)胞染色體數(shù)2n=42，并分析了5、10、30代染色體數(shù)，2n所站的比率分別為90.16％、86.20％、83

3、.07％。用含10％FBS和10％ DMSO的DMEM為冷凍液，解凍后細(xì)胞活率經(jīng)FDA/PI染色檢測(cè)，細(xì)胞活率都在93％以上，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度和形態(tài)沒(méi)有明顯變化。細(xì)菌、真菌污染檢測(cè)結(jié)果:接種單層細(xì)胞的液體培養(yǎng)基和陰性對(duì)照一樣，沒(méi)有混濁或其它變化;病毒檢測(cè)結(jié)果，紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性;支原體檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)采用了Hoechst33258熒光染色法，未檢查到細(xì)胞被支原體污染。乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶同工酶電泳圖譜正常，沒(méi)有交叉污染。食蟹猴

4、耳部成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色和紅色熒光蛋白質(zhì)粒的效率分別為8.12％和12.35％。微量保存食蟹猴耳部皮膚成纖維細(xì)胞是一種可行的辦法。
　　 2.供體核與受體胞質(zhì)細(xì)胞周期同步與否是影響克隆胚胎發(fā)育以及克隆成功的重要因素之一。我們用幾種方法調(diào)控食蟹猴耳皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期，以期獲得高比例的G0/G1期細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)固定、染色后用流式細(xì)胞儀(FACS)分析細(xì)胞周期分布，Hoechst33342染色評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡水平。實(shí)驗(yàn)1研究了血清饑餓、接

5、觸抑制處理1、3、5天和正常培養(yǎng)對(duì)各細(xì)胞周期分布的影響;實(shí)驗(yàn)2分析不同的抗氧化劑(β-巰基乙醇10mM;半胱氨酸2 mM)處理4、24小時(shí)對(duì)細(xì)胞周期分布的影響;實(shí)驗(yàn)3中研究三個(gè)蛋白酶抑制劑（6-DMAP2mM; CHX7.5mg/ml; CB7.5mg/ml）分別處理不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期分布的影響;實(shí)驗(yàn)4中研究15μM Roscovitine處理24、48、72小時(shí)用FCS分析細(xì)胞周期分布;實(shí)驗(yàn)5比較不同濃度DMSO(0％，0.5％，1.

6、0％and2.5％)處理4和24小時(shí)對(duì)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的影響。血清饑餓和接觸抑制都可以提高G0/G1期細(xì)胞比率，顯著高于對(duì)照組(67.52％)(p＜0.05)。10 mMβ-巰基乙醇處理24小時(shí)可以顯著提高G0/G1期細(xì)胞比率(82.04％)差異顯著(p＜0.05)，2mM半胱氨酸處理24小時(shí)G0/G1期細(xì)胞比率為84.66％差異顯著。6-DMAP，CB處理24小時(shí)相對(duì)于對(duì)照組可以顯著提高G0/G1期細(xì)胞比率，G0/G1期細(xì)胞比率

7、分別為71.26％，79.89％。CHX處理24小時(shí)和48小時(shí)均顯著提高G0/G1期細(xì)胞比率，數(shù)值分別為79.72％和97.94％。15μM Roscovitine處理24、48和72小時(shí)G0/G1期細(xì)胞比率分別為76.51％，89.69％。90.49％，其中48小時(shí)和72小時(shí)處理組顯著高于24小時(shí)處理組和對(duì)照組(p＜0.05)。1.5％ and2.0％ DMSO處理4小時(shí)(82.86％，86.31％) G0/G1期細(xì)胞比率顯著(p＜0

8、.05)高于其它4小時(shí)(0.5％ DMSO for78.84％，1.0％ DMSO for78.65％)處理組和對(duì)照組(67.52％)。1％(90.45％％)，1.5％(91.57％) and2.0％ DMSO(98.68％)處理24小、時(shí)比0.5％ DMSO(78.22％)對(duì)照組(67.52％)獲得較好的同期化效果(p＜0.05)。對(duì)照組有4.63％的細(xì)胞凋亡，1.5％、2％ DMSO處理4小時(shí)，1％、1.5％、2％ DMSO處理24

9、 h導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡的比率分別為10.52％，12.75％，10.42％，12.75％，17.07％。2％ DMSO處理24小時(shí)可以有效的提高G0/G1期細(xì)胞比率，同時(shí)也增加了細(xì)胞凋亡的比率(p＜0.05)。
　　 3.供體細(xì)胞在受體卵胞質(zhì)中DNA不完全甲基化重編程是導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育失敗的主要原因。5-脫氧雜氮胞苷（5-azaC）為一種胞嘧啶核苷類似物，在DNA復(fù)制過(guò)程中可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)結(jié)合形成一種共價(jià)復(fù)合物，

10、抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性，而達(dá)到去甲基化的作用。本研究檢測(cè)不同濃度的5-脫氧雜氮胞苷對(duì)食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞的增殖、核型、凋亡及細(xì)胞周期的影響。我們用0.08、0.31、1.25、5μM5-azaC處理食蟹猴成纖維細(xì)胞，隨著5-azaC濃度的增加細(xì)胞形態(tài)明顯改變，當(dāng)5-azaC濃度達(dá)到5μM時(shí)，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，細(xì)胞形態(tài)不再是典型的梭狀，不再飽滿，變得扁平，所有的藥物處理都會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，1.25μM和5μM5-azaC處理組的生長(zhǎng)速度比

11、其它組要慢，0.08μM和0.31μM處理組更接近沒(méi)有藥物處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)特征。用FITC AnnexinⅤ Apoptosis Detection KitⅠ試劑盒染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各處理組96h的凋亡情況，各處理組早期凋亡比例都比對(duì)照組要高(0μM:2.52％，0.08μM:6.91％，0.31μM:8.39％，1.25μM:8.61％，5μM:8.93％)，5-azaC處理食蟹猴成纖維細(xì)胞96小時(shí)可以引起細(xì)胞的早期凋亡，5μM5-

12、aza處理細(xì)胞表現(xiàn)出高的晚期凋亡和壞死，顯著高于其它各組，0.08、0.31、1.25μM5-azaC可以導(dǎo)致細(xì)胞的晚期凋亡和壞死，顯著高于對(duì)照組(0μM:7.71％，0.08μM:12.47％，0.31μM:13.72％，1.25μM:14.18％，5μM:24.98％)。不同濃度5-azaC處理96小時(shí)后的細(xì)胞染色體數(shù)目，在對(duì)照組和0.08、0.31μM5-azaC處理組，大于81％的細(xì)胞是二倍體，0.08μM和0.31μM5-az

13、aC與對(duì)照組差異不顯著，1.25μM5-azaC(76.6％)和5μM5-azaC(68.8％)處理組二倍體下降，顯著高于對(duì)照組(87.3％)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)5-azaC處理96小時(shí)細(xì)胞周期，5-azaC各濃度處理沒(méi)有對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生明顯影響。隨著5-azaC濃度的增加，處理細(xì)胞的甲基化水平有所下降，其中0.31、1.25、5μM5-azaC處理組要顯著低于0.08μM5-azaC處理組和對(duì)照組。
　　 4.TSA是一種組蛋白去乙

14、?；敢种苿?，TSA可以通過(guò)抑制組蛋白去乙?；傅淖饔脧亩谷旧|(zhì)處于超乙酰化狀態(tài)，激活發(fā)育相關(guān)基因，利用TSA處理核移植的供體細(xì)胞，可以提高克隆胚胎的發(fā)育。本研究的目的在于采選最佳的TSA濃度用以食蟹猴體細(xì)胞核移植的相關(guān)研究。不同濃度TSA對(duì)食蟹猴耳部皮膚成纖維細(xì)胞增殖均有抑制作用，0.08μM和0.1μM TSA比其它各組的增殖要慢，形態(tài)有所改變。不同濃度TSA對(duì)食蟹猴耳部皮膚成纖維細(xì)胞的凋亡成劑量依賴模式。TSA處理組的凋亡率分別

15、為3.38±0.12％(0μM),4.04±0.11％(0.01μM),5.13±0.29％(0.03μM),6.75±0.45％(0.05μM),9.95±0.78％(0.08μM),12.55±0.65％(0.1μM),對(duì)照組與0.01μM TSA和0.03μM TSA處理組差異不顯著(P＞0.05)，0.08μM TSA和0.1μM TSA顯著高于對(duì)照組、0.01μM TSA、0.03μM TSA處理組差異顯著(P＜0.05)。T

16、SA對(duì)食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響，高濃度的TSA(0.1μM)可以提高G0/G1期細(xì)胞比率，與其它各處理組及對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。不同濃度TSA對(duì)食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞染色體倍性的影響。隨著TSA濃度的增大，2n所占比率有所下降，至0.08和0.1μM，2n所占的比率與其它各組差異顯著(P＜0.05)。隨著TSA濃度的增大，處理細(xì)胞的乙?；皆龈撸兴幬锾幚斫M都要高于對(duì)照組。
　　 5.利用核移植技術(shù)，將

17、食蟹猴耳部皮膚成纖維細(xì)胞融于去核豬卵母細(xì)胞中，經(jīng)融合和活化后，體外培養(yǎng)，并進(jìn)行了相關(guān)的研究。結(jié)果表明，TCM-199和NCSU-23對(duì)豬卵母細(xì)胞的體外成熟和卵丘擴(kuò)展有相同的效果，44h和48h的卵母細(xì)胞的去核率為82.26％和81.36％，顯著高于IVM60h卵的去核率(70.21％)。PZM-3培養(yǎng)豬胚胎的效果好于NCSU-23。在研究不同的電擊參數(shù)試驗(yàn)中，1.4k V/cm，80μs，1 DC處理組的死亡率顯著高于其它兩個(gè)參數(shù)(1.

18、2k V/cm，30μs，2 DC;2.0k V/cm，50μs，1 DC)。豬同種核移植重構(gòu)胚胎的融合參數(shù)適合食蟹猴-豬異種核移植重構(gòu)胚胎的融合;豬卵子的去核胞質(zhì)可以對(duì)食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞核重新去分化。比較了同種核移植中不同供體細(xì)胞對(duì)重構(gòu)胚胎發(fā)育能力的影響，三種供體細(xì)胞，發(fā)育到囊胚的比率分別為20.45％（豬胎兒成纖維細(xì)胞，），7.35％（豬卵丘顆粒細(xì)胞），5.95％（豬耳部皮膚成纖維細(xì)胞），胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞得到了最高的發(fā)育

19、率，顯著高于耳部皮膚成纖維細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞為供核細(xì)胞的發(fā)育率，以食蟹猴耳部皮膚成纖維細(xì)胞做為供核細(xì)胞獲得了8.67％的囊胚發(fā)育。以不同培養(yǎng)代數(shù)的細(xì)胞用作核移植供體，我們比較了1-3代，4-6代，7-10代食蟹猴耳部皮膚成纖維細(xì)胞作核移植供體，對(duì)異種重構(gòu)胚的體外發(fā)育率沒(méi)有顯著的影響。用PZM-3或者HECM-9以及H和P按體積1∶1混合，三種培養(yǎng)液發(fā)育至囊胚的比率分別為10.7％，8.7％和8.0％。在研究不同培養(yǎng)溫度對(duì)異種重構(gòu)胚胎發(fā)育

20、的實(shí)驗(yàn)中:37℃，39℃(4D)+37℃，37℃(4D)+39℃三組發(fā)育至囊胚的比率分別為1.0％，0.3％，1.3％，顯著低于39℃全程培養(yǎng)的結(jié)果(9.47％)。共培養(yǎng)沒(méi)有提高異種重構(gòu)胚胎的發(fā)育。15μMRoscovitine處理48小時(shí)體細(xì)胞可以提高同種(14.23％)和異種(15.05％)胚胎發(fā)育，顯著高于對(duì)照組。用0.03μM TSA和0.31μM5-azaC處理食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞96小時(shí)，檢測(cè)胚胎發(fā)育的水平，對(duì)照組和0.03

21、μM TSA和0.31μM5-azaC處理的囊胚發(fā)育分別為7.63％，8.54％，7.42％。
　　 6.在體細(xì)胞克隆中，線粒體主要來(lái)源于受體卵母細(xì)胞。然而在異種核移植中，由于核供體和胞質(zhì)受體來(lái)源于兩個(gè)遺傳上關(guān)系較遠(yuǎn)的種或?qū)?，兩種不同來(lái)源的線粒體DNA(mtDNA)在重構(gòu)胚早期發(fā)育中的動(dòng)態(tài)變化還不清楚。本文定量研究了豬卵胞質(zhì)重編程的食蟹猴胚胎中食蟹猴和豬mtDNA的水平。實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明植入前克隆胚胎中兩種來(lái)源的線粒體