豬體細(xì)胞核移植去核效率的研究.pdf

1、本研究對(duì)屠宰場(chǎng)廢棄的豬卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)后，用不同濃度的細(xì)胞松弛素B（CB）處理，經(jīng)盲吸法去核，觀察去核效率；用不同的激活劑對(duì)卵母細(xì)胞預(yù)激活處理，通過(guò)脫羧秋水仙堿(DC)和放線菌酮(CHX)對(duì)卵母細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，比較不同激活劑對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)去核的影響；同時(shí)，對(duì)不同成熟時(shí)間培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞用盲吸法和化學(xué)誘導(dǎo)法去核，比較去核方法和不同成熟培養(yǎng)時(shí)間對(duì)去核效率的影響；分別以盲吸法和化學(xué)去核法的卵母細(xì)胞為受體細(xì)胞，豬耳成纖維細(xì)胞為供核體細(xì)胞，

2、進(jìn)行豬體細(xì)胞核移植，對(duì)重構(gòu)胚的體外發(fā)育進(jìn)行了觀察。旨在確定細(xì)胞松弛素B在盲吸法去核中的最佳濃度；篩選化學(xué)誘導(dǎo)去核法的最佳預(yù)激活劑以及兩種去核方法的最佳去核時(shí)間和探索嶄新的化學(xué)試劑誘導(dǎo)去核卵母細(xì)胞為核受體的體細(xì)胞核移植方法。為豬體細(xì)胞克隆技術(shù)研究中卵母細(xì)胞去核這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)提供理論依據(jù)。通過(guò)研究，結(jié)果如下： 1. 不同濃度的細(xì)胞松弛素Ｂ對(duì)豬卵母細(xì)胞去核的影響 比較不同濃度的細(xì)胞松弛素Ｂ對(duì)豬卵母細(xì)胞去核的影響。結(jié)果顯示，用不同

3、濃度CB處理后的卵母細(xì)胞的成功去核率均顯著高于未處理組卵母細(xì)胞的去核率（P<0.05）；CB處理組之間的結(jié)果表明，5×10－3、6.5×10－3mg/mL濃度組的去核成功率顯著高于其它兩組的去核成功率（P<0.05），而卵母細(xì)胞的潰破率顯著低于其它處理組和對(duì)照組（P<0.05）。CB在體外成熟培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞去核操作中能提高去核成功率，并減少卵母細(xì)胞質(zhì)膜的破潰。濃度在5×10－3、6.5×10－3mg/mL較為理想。 2. 不

4、同激活劑對(duì)豬卵母細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)去核法去核效率的影響 用7％乙醇、10mg/L細(xì)胞松弛素B、0.1mM的氯化鈣分別預(yù)激活卵母細(xì)胞后化學(xué)誘導(dǎo)去核。結(jié)果標(biāo)明, 激活劑處理后的卵母細(xì)胞與未處理的卵母細(xì)胞形態(tài)略有差異，7％乙醇激活處理的卵母細(xì)胞染色質(zhì)收縮，細(xì)胞皺縮和變形。10mg/LCB激活后的卵母細(xì)胞形態(tài)上與未處理的卵母細(xì)胞差異不顯著。0.1mM的CaCl2激活后引起卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育，發(fā)生卵裂。各組之間的去核率差異顯著（P<0.05），其

5、中，10mg/L CB激活組的去核率顯著高于其它各組（P<0.05）。 3. 豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)間及去核方法的研究 將卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)分成不同的時(shí)間組，分別采用盲吸法和化學(xué)誘導(dǎo)去核法去核。結(jié)果表明，不同時(shí)間成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞用盲吸法去核，體外成熟培養(yǎng)（IVM）39-41h 組去核率最高，與IVM36-38h組差異顯著（P<0.05），與42-44h兩組差異不明顯, 但三組去核率顯著高于IVM45-48h組（P<0

6、.05）。不同時(shí)間成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞經(jīng)化學(xué)去核, IVM36-38h，39-41h，42-44h,45-48h的去核率分別為44.09％，55.58％,58.12％,36.12％。IVM42-44h去核率最高，但與IVM39-41h的去核率差異不顯著（P>0.05），與其他各組之間差異顯著（P<0.05）。在相同的時(shí)間組內(nèi)，盲吸法的去核率比化學(xué)誘導(dǎo)法的去核率高。IVM42-44h，兩種方法的去核率差異不顯著。IVM36-38h，39-4

7、1h，45-48h兩種方法的去核率差異顯著（P<0.05）。顯示，不同的去核方法對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)間不同；盲吸法去核的最佳時(shí)間在39-41h；化學(xué)誘導(dǎo)去核的時(shí)間以42-44h成熟培養(yǎng)為宜。 4. 豬耳成纖維細(xì)胞核移植研究 以豬耳成纖維細(xì)胞為供核體細(xì)胞，用胞質(zhì)內(nèi)注射法進(jìn)行豬體細(xì)胞核移植。核移植48h后，重構(gòu)胚的卵裂率為，盲吸法去核后的卵母細(xì)胞體細(xì)胞注入后的卵裂率為20％，化學(xué)誘導(dǎo)去核卵母細(xì)胞核移植后的卵裂率為25％，