mRFP1-獼猴-豬異種體細(xì)胞核移植胚胎核重編程的研究.pdf

1、獼猴異種間體細(xì)胞核移植(iSCNT)能夠在避免倫理道德的實驗限制下，得到與人類具有相似遺傳背景的克隆胚胎，為今后利用囊胚互補技術(shù)獲得靈長類動物器官、建立治療性克隆非人靈長類動物模型等研究提供研究基礎(chǔ)。然而，目前僅有數(shù)例有關(guān)獼猴iSCNT胚胎的研究，且克隆胚胎的重編程及發(fā)育能力均十分低下。研究表明iSCNT胚胎發(fā)育過程中表觀遺傳修飾及重要基因表達(dá)的異常是供體核重編程不完全的主要原因。為了改善iSCNT胚胎的發(fā)育能力，深入研究組蛋白乙?；?/p>

2、飾及重要基因表達(dá)對異種間核移植胚胎重編程的影響，本研究以表達(dá)紅色熒光的獼猴皮膚成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞，以去核的豬卵母細(xì)胞為受體細(xì)胞構(gòu)建異種重構(gòu)胚，并與表達(dá)紅色熒光的豬同種間體細(xì)胞核移植(SCNT)胚胎比較了體外發(fā)育能力的差異。此外，使用不同類型的小分子化合物對異種重構(gòu)胚進行處理，探討了藥物處理對獼猴-豬iSCNT重構(gòu)胚重編程及發(fā)育能力的影響。研究結(jié)果如下:
　　一、轉(zhuǎn)單體紅色熒光蛋白(mRFP1)獼猴-豬iSCNT與豬-豬SCNT胚

3、胎發(fā)育能力的比較
　　實驗一:本實驗建立了獼猴成纖維細(xì)胞系，使用NucleofectorTM電轉(zhuǎn)染儀進行mRFP1電穿孔轉(zhuǎn)染，程序為U-023時轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染效率約75.63％。G418篩選濃度為200μg/mL，在篩選到10天時，可以獲得能穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的獼猴成纖維細(xì)胞。經(jīng)核型分析顯示，傳至第四代的mRFP1獼猴成纖維細(xì)胞中，77.36％為二倍體并具有42條形態(tài)正常的染色體。
　　實驗二:mRFP1-獼猴-豬iS

4、CNT重構(gòu)胚的卵裂率為71.53％，mRFP1-豬-豬SCNT重構(gòu)胚的卵裂率為80.30％，兩者在卵裂率上并無顯著性差異。然而，mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎的囊胚率為2.04％，顯著低于mRFP1-豬-豬SCNT胚胎的囊胚率(10.19％，P＜0.05)。大部分mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎發(fā)育阻滯在8-16階段，而不能達(dá)到囊胚階段。
　　二、去乙?；敢种苿?HDACi)對mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎發(fā)育能力的影

5、響
　　實驗一:2 mM valproic acid(VPA)處理豬-豬SCNT克隆胚胎24 h后，囊胚率顯著高于對照組，分別為20.04％和10.66％(P＜0.05)，表明VPA能夠顯著提高豬-豬SCNT克隆胚胎發(fā)育能力。在mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎中，0、2、4、8 mM VPA處理iSCNT胚胎的卵裂率分別為72.34％，70.69％，68.24％，70.48％，囊胚率分別為1.24％，1.29％，1.17％，0.

6、83％，均無顯著性差異。2 mM VPA分別對mRFP1-獼猴-豬iSCNT重構(gòu)胚培養(yǎng)0、12、24、48 h，結(jié)果顯示囊胚率分別為1.10％，1.28％，1.36％和0.86％，并沒有顯著性差異。
　　實驗二:使用1μM CUDC-101處理豬-豬SCNT克隆胚胎24 h后，囊胚率顯著高于對照組，分別為24.61％和11.58％(P＜0.05)，表明CUDC-101能夠顯著提高豬-豬SCNT克隆胚胎發(fā)育能力。在mRFP1-獼猴-

7、豬iSCNT胚胎中，0、0.1、1、10μM CUDC-101處理iSCNT胚胎卵裂率(61.31％，62.37％，65.00％，57.90％)、囊胚率(1.22％，1.06％，1.34％，0.95％)均無顯著性差異。1μM CUDC-101分別對mRFP1-獼猴-豬iSCNT重構(gòu)胚培養(yǎng)0、12、24、48 h，結(jié)果顯示與對照組相比，各處理組的卵裂率(68.23％，64.92％，67.91％，62.14％)和囊胚率(1.53％，1.42

8、％，2.06％，1.32％)均無顯著性差異。
　　實驗三:采用2 mM的VPA、1μM CUDC-101對iSCNT激活后胚胎處理6h。通過acH3K9免疫染色可以看出，VPA、CUDC-101處理胚胎的acH3K9水平與對照組無顯著差異。
　　三、小分子化合物RepSox對mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎重編程的影響
　　實驗一:在豬-豬SCNT胚胎中在添加濃度為0、5、25、50μM的RepSox處理24 h后，

9、結(jié)果顯示，各組間囊胚發(fā)育率并無顯著性差異(10.47％，14.53％，15.39％，7.12％)，因此，使用囊胚率最高的25μM處理組作為接下來實驗的處理濃度;25μM RepSox處理0、1、2、4、7d后，囊胚發(fā)育率相均無顯著性差異(10.28％,14.22％,12.05％,12.81％,7.06％)。
　　實驗二:使用5、25、和50μM的RepSox分別對mRFP1-獼猴-豬克隆胚胎處理1d，表達(dá)紅色熒光的胚胎被判定為是m

10、RFP1-獼猴-豬克隆胚胎。結(jié)果顯示，5、25、50μM RepSox處理組(1.66％，2.07％，0.62％)與對照組(1.09％)之間沒有顯著差異。利用25μM的RepSox處理異種重構(gòu)胚1、2、4、7d，結(jié)果表明處理1、2、4、7d的異種重構(gòu)胚的囊胚率與對照組相比，未達(dá)到顯著性差異(2.39％和1.95％,1.13％,0％,1.23％)。
　　實驗三:為了檢測RepSox處理對mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎Oct4的作

11、用，Oct4免疫染色可以看出RepSox處理iSCNT囊胚期的Oct4水平顯著高于未處理的iSCNT囊胚（P＜0.05）。
　　實驗四:25μM RepSox處理mRFP1-獼猴-豬iSCNT胚胎1d后，檢測2-4細(xì)胞期iSCNT胚胎的mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果表明Oct4和Nanog的mRNA水平均顯著高于未處理組(P＜0.05)，而Sox2的表達(dá)量無顯著性差異。RepSox處理的iSCNT胚胎的Bax和Bcl2水平均有不同程度的

12、升高，但是Bax/Bcl2的比率沒有顯著性差異。
　　以表達(dá)單體紅色熒光蛋白的獼猴成纖維細(xì)胞進行獼猴-豬異種核移植胚胎，簡單、直觀、有效的判定了異種重構(gòu)胚核的來源。兩種去乙酰化抑制劑沒有對獼猴-豬異種移植胚胎的表觀遺傳及發(fā)育能力產(chǎn)生影響。但是另一種小分子化合物RepSox提高了獼猴-豬異種克隆配重多能性相關(guān)基因Oct4和Nanong的表達(dá)量，間接的提高了胚胎的發(fā)育能力。雖然沒有提高異種克隆胚胎發(fā)育到囊胚的能力，但是為提高異種核移植