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文檔簡介
1、目的:(1)以正常黃瓜(Cucumis sativus L.)(新泰密刺)和芽黃突變體黃瓜(新泰密刺)為研究對象,篩選正常與芽黃突變體黃瓜中的ClpP基因,分析其核酸序列并預測相關蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。為后期研究芽黃相關基因ClpP的作用機制提供目標序列和研究基礎。(2)構(gòu)建芽黃相關基因ClpP的植物表達載體,并進行該基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化,通過生理性狀分析該基因功能。
方法:(1)分別提取正常黃瓜和芽黃突變體黃瓜不同生長時期葉
2、片的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用特異性引物PCR擴增得到芽黃相關基因ClpP的cDNA序列核心序列,連接到pGEM-T載體后測序,測序結(jié)果經(jīng)Blaxtn和GenBank公共數(shù)據(jù)庫進行比對分析。(2)含目的片段的pGEM-T載體和農(nóng)桿菌EhA105經(jīng)雙酶切后分別獲得目的條帶和表達載體,用連接酶連接獲得重組子后經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并用該農(nóng)桿菌侵染煙草愈傷組織。愈傷組織誘導分化發(fā)芽后,觀察其生理性狀分析其功能。
結(jié)果:(1
3、)經(jīng)測序后得到正常黃瓜和芽黃突變體ClpP基因序列為494bp??删幋a164個氨基酸。從1到132氨基酸之間有S14_ClpP_2保守結(jié)構(gòu)域,沒有信號肽,推測其可能不是分泌蛋白。與預測的黃瓜葉綠體合成全基因組比對發(fā)現(xiàn),該基因有三個外顯子,二個內(nèi)含子組成,但本研究只獲得了兩個外顯子序列。將該基因氨基酸序列與其他七種植物的氨基酸序列進行比對,并進行系統(tǒng)進化分析,發(fā)現(xiàn)黃瓜最先和毛茛屬植物(Ranunculus macranthus)聚類,再和
4、擬南芥1(Arabidopsis thaliana)聚類。(2)攜帶正常和芽黃黃瓜的ClpP基因的農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化獲得的煙草均未出現(xiàn)明顯的芽黃現(xiàn)象。
結(jié)論:(1)正常黃瓜與芽黃突變體的ClpP基因序列與結(jié)構(gòu)完全相同,他們含有相同的高度保守的結(jié)構(gòu)域S14_ClpP_2,在黃瓜芽黃現(xiàn)象中該基因可能在調(diào)控水平發(fā)揮作用。(2)攜帶正常和芽黃黃瓜的ClpP基因農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化試驗中未獲得出現(xiàn)芽黃現(xiàn)象的煙草植株,這種現(xiàn)象可能有以下
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