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文檔簡介
1、干旱嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì),20世紀(jì)80年代以來我國棉花旱情有加重的趨勢,每年應(yīng)旱災(zāi)減產(chǎn)的棉花總量達(dá)到30%以上。特別在棉花主產(chǎn)區(qū)新疆,干旱乃是限制其產(chǎn)量的主要因素。干旱對棉花產(chǎn)量的影響在各種非生物的環(huán)境脅迫因子中占首位,僅次于生物脅迫即病蟲害所造成的損失。干旱直接影響棉花正常代謝和生長發(fā)育;干旱導(dǎo)致棉花細(xì)胞脫水,膜系統(tǒng)和酶系統(tǒng)遭到破壞,使細(xì)胞功能喪失,最終導(dǎo)致植株的代謝紊亂,進(jìn)而引起蛋白合成受阻,激素平衡破壞。因此,通過分子生物學(xué)手段
2、研究棉花抗旱基因及作用機(jī)制,從而提高棉花抗旱能力,培育抗旱品種已成為重要的課題。
本研究以抗旱陸地棉材料中H177為實(shí)驗材料,通過抗旱抑制消減cDNA文庫(SSH)篩選到兩個抗旱相關(guān)基因的EST,利用RACE及RT-PCR技術(shù)克隆了2個陸地棉干旱脅迫相關(guān)基因的cDNA全長,命名為GhTrx和GhGR。利用熒光定量PCR技術(shù)對兩個基因做了抗旱相關(guān)性表達(dá)分析,并通過GFP對其基因亞細(xì)胞定位,擬南芥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因槍活體轉(zhuǎn)化
3、技術(shù)對2個基因功能做了進(jìn)一步研究分析。
獲得陸地棉2個抗旱相關(guān)GhTrx和GhGR基因cDNA全長序列。其中GhTrx基因cDNA全長1340bp,它包括5’-UTR191bp,完整開放閱讀框864bp,3’-UTR285bp,編碼287個氨基酸殘基的多肽。GhGR基因cDNA全長1035bp,它包括5’-UTR122bp,完整開放閱讀框792bp和3’-UTR121bp,編碼263個氨基酸殘基的多肽。
生物
4、信息學(xué)分析表明,GhTrx基因編碼蛋白與楊樹、蓖麻、擬南芥的相似性分別為70%、72%和76%,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示GhTrx與蓖麻中該蛋白的親緣關(guān)系最近,同源結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明該基因有3個保守結(jié)構(gòu)域,二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,該蛋白是由α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成。GhGR蛋白與氨基酸序列比對和同源性分析顯示該基因與楊樹、蓖麻、葡萄同源性最高,分別90%、91%和91%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,GhGR與葡萄中該蛋白的親緣關(guān)系最近??缒そY(jié)構(gòu)
5、域分析表明,該基因有1個跨膜結(jié)構(gòu)域。
在抗旱材料中H177不同的組織和不同干旱處理時期材料,進(jìn)行Real-time PCR分析。結(jié)果表明,干旱脅迫下,GhTrx和GhGR基因在干旱材料的根、莖和葉中受到誘導(dǎo)表達(dá),且在根和葉中2個基因的表達(dá)量高于莖中。由此可推測該基因在干旱脅迫時,根、莖和葉中能進(jìn)行大量表達(dá)以抵抗外界的干旱威脅,但根和葉部該基因的表達(dá)對應(yīng)對干旱逆境脅迫起著關(guān)鍵性的作用,有實(shí)驗可知GhTrx和GhGR基因可能在
6、提高陸地棉抗旱性上發(fā)揮一定作用。
構(gòu)建GFP-GhTrx和GFP-GhGR植物熒光表達(dá)載體,基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)GhTrx蛋白定位于洋蔥的細(xì)胞膜上,GhGR蛋白可能定為在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。
構(gòu)建pBI121-GhTrx植物超表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,獲得轉(zhuǎn)GhTrx基因T3擬南芥種子,進(jìn)行抗旱性分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因的植株能提高擬南芥的抗旱性,由實(shí)驗可知陸地棉的GhTrx基因的超量表達(dá)能提高擬南芥的
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