黃瓜轉(zhuǎn)酮醇酶基因的克隆及功能分析.pdf

1、轉(zhuǎn)酮醇酶(Transketolase，TK)是一種焦磷酸硫胺素依賴性酶，參與高等植物的卡爾文循環(huán)，在很大程度上控制著光合碳固定和RuBP再生。為了探明TK對光合作用的調(diào)控機(jī)理，本文以‘津優(yōu)3號’黃瓜（Cucumis sativaL.）為試材，克隆TK基因，分析其基因表達(dá)特性;構(gòu)建正、反義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黃瓜，系統(tǒng)分析其基因功能和轉(zhuǎn)基因植株在日光溫室中的應(yīng)用潛力。主要結(jié)果如下:
　　1.利用同源序列設(shè)計(jì)簡并引物，通過R

2、T-PCR法從黃瓜葉片克隆到TK基因的中間片段，大小為526 bp，通過Race法獲得該基因全長，大小為2368 bp，ORF為2229 bp，編碼742個(gè)氨基酸，分子量為80.62 kDa，在Genbank上登錄號為JF972598，命名為CsTK。
　　2.氨基酸同源序列比較發(fā)現(xiàn)，黃瓜的TK氨基酸序列與玉米、煙草、馬鈴薯、側(cè)莖頭菊和擬南芥的TK氨基酸序列同源性分別為87％、92％、93％、83％和89％。在TK氨基酸的N-末端

3、有一段富含絲氨酸的氨基酸序列，可以識別葉綠體，保證TK順利進(jìn)入葉綠體。
　　3.構(gòu)建了原核表達(dá)體pET-CsTK,并在大腸桿菌BL21(DE3) plysS中誘導(dǎo)表達(dá)。以重組蛋白免疫Ba1b/c雌性小白鼠，制備抗體，效價(jià)為1∶500，可以檢測CsTK在蛋白水平上的表達(dá)。
　　4.Real-time PCR和Western雜交結(jié)果顯示，TK在黃瓜葉、莖、果實(shí)和根中均有表達(dá)，其中葉片中表達(dá)量最高;在不同葉位中以上數(shù)第4片展開葉表

4、達(dá)量最高，顯著高于頂部葉和基部葉的表達(dá)量，中位葉的活性也顯著高于頂部葉和基部葉;晴天條件下，黃瓜功能葉片的TK基因表達(dá)量和活性日變化與Pn的日變化趨勢一致，呈單峰曲線型，其高峰出現(xiàn)在14:00，說明TK參與黃瓜葉片Pn日變化。
　　5.TK基因受高溫強(qiáng)光(40℃/1600μmol·m-2·s-1)和低溫弱光（5℃/100μmol·m-2·s-1）誘導(dǎo)，說明TK與黃瓜對短時(shí)溫光脅迫的防御機(jī)制有關(guān);低溫弱光脅迫時(shí)間超過24 h時(shí)，其基

5、因表達(dá)量和酶活性趨于下降，可見，TK對高溫強(qiáng)光的忍受能力要高于其對低溫弱光的忍受能力，長時(shí)間低溫弱光導(dǎo)致黃瓜TK活性和基因表達(dá)量下降是引起其Pn降低的重要原因之一。
　　6.將獲得的TK基因全長與含有35 S的pBI121載體重組，分別構(gòu)建了正、反義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黃瓜子葉節(jié)，用Real-time PCR和Western雜交法對具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)正義植株中的CsTK過量表達(dá)，而轉(zhuǎn)反義植株中

6、表達(dá)量顯著下降。
　　7.正義轉(zhuǎn)基因黃瓜種子飽滿，發(fā)芽率與野生型的差異不顯著;而反義株系的種子干癟，發(fā)芽率低。CsTK過量表達(dá)可使黃瓜葉片的TK活性、Pn及卡爾文循環(huán)其他酶活性與mRNA表達(dá)量顯著升高，碳水化合物積累量增多，初花期提前2d，雌花比例顯著提高，前期產(chǎn)量明顯增加;CsTK沉默時(shí)，結(jié)果相反。
　　8.低溫弱光脅迫6h時(shí)，黃瓜葉片的Pn顯著降低，電解質(zhì)滲漏率(EL)明顯升高。轉(zhuǎn)正義黃瓜植株的Pn的降低程度和EL升高程