黃瓜響應(yīng)低氮脅迫基因CsAOC3的克隆和功能分析.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國(guó)重要的園藝作物之一。黃瓜也是一種典型的喜氮作物，氮素缺乏會(huì)嚴(yán)重影響植株的生長(zhǎng)，最終影響黃瓜的產(chǎn)量及品質(zhì)。為了追求更高的產(chǎn)量，黃瓜生產(chǎn)上會(huì)出現(xiàn)過(guò)量施用氮肥的現(xiàn)象，過(guò)量施用氮肥時(shí)作物對(duì)氮的利用率低，并且殘留的氮肥會(huì)破壞農(nóng)業(yè)及生態(tài)環(huán)境，科學(xué)施用氮肥的同時(shí)挖掘黃瓜響應(yīng)低氮基因、培育響應(yīng)低氮黃瓜品種是解決上述問(wèn)題的有效途徑。
　　本研究以黃瓜D0328為試驗(yàn)材料，結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果，利用RT-

2、PCR同源序列克隆技術(shù)，克隆黃瓜響應(yīng)氮素脅迫相關(guān)基因CsAOC3，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)CsAOC3表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，并進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)果，篩選獲得了一個(gè)可能參與黃瓜響應(yīng)氮素脅迫的基因CsAOC3，以黃瓜葉片cDNA為模板，利用黃瓜基因組網(wǎng)站基因序列信息設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出1條約750 bp的亮帶，測(cè)序結(jié)果表明其基因全長(zhǎng)為753 bp，蛋白編碼

3、251個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為27.17 kD，不穩(wěn)定系數(shù)為51.92，理論等電點(diǎn)為8.93，平均親水系數(shù)為-0.155。蛋白同源比對(duì)結(jié)果表明CsAOC3與白梨、喜樹(shù)、綠豆等16種植物AOC蛋白有65％-94％的同源性，其中與甜瓜的親緣關(guān)系更近，為94％。經(jīng)Target分析預(yù)測(cè)該蛋白最可能定位于葉綠體中。
　　(2)熒光定量結(jié)果表明，和正常氮處理相比，響應(yīng)低氮脅迫的黃瓜品種D0328在低氮脅迫條件下CsAOC3的表達(dá)量顯著上調(diào)，

4、增加了11倍之多;而塒于響應(yīng)低氮脅迫弱的黃瓜品種D0422，在低氮脅迫處理和正常氮處理時(shí)CsAOC3的表達(dá)量并沒(méi)有明顯變化
　　(3)為了研究CsAOC3在植物響應(yīng)氮素過(guò)程中的功能，首先構(gòu)建CsAOC3基因的過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入擬南芥，經(jīng)篩選獲得了3個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，分別對(duì)其進(jìn)行低氮和正常氮處理，對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。與正常氮處理相比，在低氮處理?xiàng)l件下野生型和轉(zhuǎn)基因植株根長(zhǎng)都顯著減少，但轉(zhuǎn)基因植株的