果梅雌蕊發(fā)育相關(guān)基因的克隆及功能分析.pdf

1、果梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)原產(chǎn)于中國(guó)，為薔薇科李屬植物。梅花具很高的觀賞價(jià)值，梅果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富。果梅中雌蕊敗育現(xiàn)象嚴(yán)重，并且嚴(yán)重影響果梅產(chǎn)量。本研究利用國(guó)家果梅種質(zhì)資源圃果梅品種‘大嵌蒂’和‘龍眼’為試材，通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)，分離克隆了果梅PmKNAT2和PmCCoAOMT基因。通過生物信息學(xué)分析基因序列結(jié)構(gòu)和功能;對(duì)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析，其編碼蛋白進(jìn)行洋蔥表皮亞細(xì)胞定

2、位研究;將PmCCoAOMT基因轉(zhuǎn)模式植物煙草(Nicotiana)對(duì)其功能進(jìn)行初步鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　1、果梅PmKNAT2基因克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析。在NCBI中查找與果梅相似性很高的桃的KNOPE2基因(KNAT2基因的同源基因)序列(EF093491)，根據(jù)桃的KNOPE2基因序列設(shè)計(jì)特異引物，從‘大嵌蒂’果梅中獲得一個(gè)KNAT2基因的同源基因，命名為PmKNA T2基因。PmKNA T2基因cDNA全長(zhǎng)為1

3、402bp，5'UTR47bp，3'UTR293bp，編碼區(qū)全長(zhǎng)為1062bp，編碼353個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為40.41kD，理論等電點(diǎn)為4.85。該基因編碼的氨基酸具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:MEINOX結(jié)構(gòu)域(KNOXⅠ和KNOXⅡ兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域)和HD(homomeodomain)結(jié)構(gòu)域，屬于KNOX蛋白;該基因與GenBank中其它來源的KNOX蛋白序列的相似性為50-100％;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明:果梅PmKNAT2基因與桃KNOX基

4、因聚為一類，表明與其親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明:該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜中。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析表明:在‘大嵌蒂’果梅不同時(shí)期花芽中PmKNAT2基因的表達(dá)量存在一定差異，PmKNAT2基因在11月份的表達(dá)量最高，9月、10月和11月的表達(dá)量差異不明顯，但其與12月和1月花芽中的表達(dá)量差異明顯;生長(zhǎng)素在1月份含量最高，9、10、11月份差異不明顯，生長(zhǎng)素含量變化趨勢(shì)與PmKNAT2基因表達(dá)趨勢(shì)相反。對(duì)該基因表達(dá)

5、量最高的11月份花芽進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn):PmKNAT2基因在各種花芽中均有表達(dá)，在不完全花（雌蕊褐色、雌蕊畸形和無雌蕊）中的表達(dá)量高于完全花（雌蕊正常）。進(jìn)一步分析PmKNAT2基因在完全花與不完全花的不同花器官中的表達(dá)量，結(jié)果表明:PmKNAT2基因在完全花與不完全花的各部位的表達(dá)量趨勢(shì)相似均為:萼片＞雄蕊＞花瓣，在完全花中雌蕊的表達(dá)量最低。
　　2、果梅PmCCoAOMT基因克隆及生物信息學(xué)分析。根據(jù)NCBI中桃的CCo

6、AOMT基因序列(DW351650.1)設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR和RACE方法在果梅品種‘大嵌蒂’和‘龍眼’中分別分離獲得PmCCoAOMT基因的完整cDNA序列和部分序列。并通過生物信息學(xué)方法分析結(jié)構(gòu)特征。兩個(gè)品種中PmCCoAOMT基因均編碼247個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)的理論分子量分別為27.91 kDa和27.89kDa，等電點(diǎn)(pI)均為5.42;親/疏水性分析表明該蛋白為親水蛋白;信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)無信號(hào)肽;亞細(xì)胞定位

7、預(yù)測(cè)推斷PmCCoAOMT蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中的可能性較大。相似性分析發(fā)現(xiàn)，兩品種中PmCCoAOMT蛋白的氨基酸序列與其它物種相比一致性在88％-96％之間。
　　3、果梅PmCCoAOMT基因表達(dá)分析及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。構(gòu)建PmCCoA OMT基因與綠色熒光蛋白基因融合植物表達(dá)載體PJIT-166-PmCCoAOMT-GFP，洋蔥表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:PmCCoAOMT基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。實(shí)時(shí)熒光定量

8、PCR分析發(fā)現(xiàn):PmCCoAOMT基因在果梅品種‘大嵌蒂’和‘龍眼’中均有表達(dá)，在雌蕊發(fā)育前期‘大嵌蒂’中的表達(dá)量高于‘龍眼’中的表達(dá)量，在雌蕊發(fā)育后期‘龍眼’表達(dá)量高;在完全花（雌蕊完好）和不完全花（雌蕊褐色）中的表達(dá)量高于不完全花（雌蕊畸形、無雌蕊）花芽中的表達(dá)量。
　　4、果梅PmCCoAOMT基因的功能分析。成功構(gòu)建了PmCCoAOMT基因的植物表達(dá)載體PBI121-PmCCoAOMT，并將構(gòu)建好的載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤