雞新城疫病毒HN09-69株主要基因的克隆、原核表達及鑒定.pdf

1、新城疫(Newcastledisease.ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起禽的高度接觸性傳染病，主要引起呼吸道，神經系統(tǒng)或腸道病變。NDV是單股負鏈的RNA病毒，為副黏病毒科副黏病毒亞科禽腮腺炎病毒屬中的一個成員，基因組編碼NP、P、M、F、HN、L6種主要結構蛋白。另外，P基因可以通過“RNA編輯”方式編碼產生額外的兩個非結構蛋白-V蛋白和W蛋白。從1926年發(fā)現(xiàn)該病以來，NDV傳播到世界

2、各個國家和地區(qū)，并對世界養(yǎng)禽業(yè)及國際貿易造成巨大的經濟損失。2009年本實驗室從中牟某發(fā)病雞場采集病料，并經病毒分離、鑒定和致病性實驗，證明病原為強毒NDV，并命名為HN09-69株。本試驗以HN09-69分離株為研究對象，對主要基因分別進行了克隆、原核表達及鑒定。運用RT-PCR技術從HN09-69分離株的基因組中分別擴增出NP、P、M、F、HN基因的全長ORF序列并測序。對NP、P、M、F、HN基因核苷酸同源性進行比較、序列和進化分

3、析，得出HN09-69株與傳統(tǒng)疫苗株LaSota、Clone-30、VG/GA、F48E8、Mukteswar同源性較低，而與水禽分離株FP1-02、SD09、SF02、SDWF02、ZJ1同源性較高，均在96％以上，并與兩鴨源分離株SD09、SF02在同一進化分支上，從基因分型上得出HN09-69株屬于當前流行的Ⅶd型。對各基因進行基于氨基酸序列的生物信息學分析，表明F、HN存在信號肽和跨膜區(qū)。
　　 其次，分別以構建的克隆質

4、粒為模板，用上下游分別含BamHⅠ、XhoⅠ位點的引物，亞克隆NP、P、V基因的ORF及M(1-798bp)、F(1119-1506bp)、HN(675-1116bp)基因片段插入到原核表達載體pET-28a(+)中，成功構建了重組原核表達質粒。將鑒定正確的原核表達質粒分別轉化BL21(DE3)宿主菌，經IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳結果表明，各重組質粒在BL21(DE3)菌中獲得了高效表達，分別在相應位置上出現(xiàn)明顯的目的蛋白條

5、帶，且NP、P蛋白以可溶性蛋白形式表達，M、F、HN、V蛋白以包涵體蛋白形式表達。然后對各蛋白表達的條件進行優(yōu)化，并對蛋白進行Western-blot鑒定。用Ni親和層析柱對NP、P進行大量純化，后與適量的佐劑混合乳化，做成疫苗，免疫42日齡SPF雞(300ag/只)。二免后第7天開始采血，并每隔7天采血一次，第21天用F48E8株進行攻毒，觀察結果LaSota免疫組的保護率為100％，NP蛋白免疫組和對照組保護率為0，P蛋白免疫組保護