新城疫病毒V4株全基因組測(cè)序及全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建.pdf

1、反向遺傳技術(shù)是近10年來迅速發(fā)展起來的一種病毒學(xué)研究方法，在研究病毒基因功能和研制新型疫苗方面有廣闊的應(yīng)用空間。新城疫病毒反向遺傳系統(tǒng)的成功建立始于1999年，迄今為止已成功拯救的病毒株包括La Sota、Clone30、BC、ZJ1等，但V4株的反向遺傳拯救系統(tǒng)尚未見報(bào)道。新城疫V4株是1966年澳大利亞學(xué)者Simmons分離到的自然弱毒，該毒株是自然無毒株，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，最大優(yōu)勢(shì)在于其獨(dú)特的耐熱性，更適合在發(fā)展中國家推廣使用。<

2、br>　　 本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的V4株進(jìn)行了三輪的蝕斑純化，由于V4株屬無毒株，其在CEF細(xì)胞中很難形成可見的蝕斑，因此我們采用了用胰酶處理V4病毒，并在上層膠中添加尿囊液及Mg2+，這樣可以偶爾產(chǎn)生可見的蝕斑，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性很差。得到的各蝕斑克隆株經(jīng)56℃水浴耐熱實(shí)驗(yàn)及-20℃反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)，比較它們的血凝性變化趨勢(shì)，選擇耐熱及耐凍融性狀更好的克隆株；實(shí)驗(yàn)表明，各克隆株之間耐熱性存在明顯差異，說明保存的V4毒是由不同的克隆株混合

3、在一起的混合體，選擇耐熱能力最強(qiáng)的11號(hào)毒株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，對(duì)各克隆株F基因內(nèi)部47-435bp的片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，比較序列后表明完全相同，說明保存的V4毒并不存在雜毒污染。
　　 設(shè)計(jì)了13對(duì)引物對(duì)全基因進(jìn)行了擴(kuò)增及測(cè)序，并最終獲得了V4株全基因序列。序列分析表明V4株基因組全長(zhǎng)15186nt，3’端和5’分別存在55nt的leader區(qū)和114nt的trailer區(qū)，中間部分包括NP、P、M、F、HN及L基因，各基因又

4、由兩端的非編碼區(qū)和中間部分的開放性閱讀框（open reading frame，ORF）組成。對(duì)各結(jié)構(gòu)蛋白的基因進(jìn)行了同源性分析及進(jìn)化樹分析，在參比的各毒株中NDV V4株NP、P、F和HN基因都是與Qv4株的同源性為最高，分別為99.9％、96.7％、100％、99.8％，M基因與HB92株同源性最高，為99.4％，與QV4株為96.8％；L基因與已知的毒株比較，與HB92同源性最高，為99.4％。
　　 設(shè)計(jì)10對(duì)引物分別擴(kuò)

5、增各個(gè)cDNA片段，并最終連接為全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒pFT7-final，使得cDNA片段連接于T7啟動(dòng)子之后：同時(shí)構(gòu)建了polⅡ啟動(dòng)子及NDV特異性核酶控制下的全長(zhǎng)cDNA克隆pFpolⅡ-V4-final。在基因組3166bp處設(shè)計(jì)引物，利用融合PER技術(shù)插入PmeI酶切位點(diǎn)，并在該位點(diǎn)插入了傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的主要抗原蛋白VP2的開放閱讀框，構(gòu)建了T7啟動(dòng)子控制下的擬表達(dá)VP2抗原的V4株全長(zhǎng)cDNA克隆pBRT7-VP2

6、。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了V4株3’leader區(qū)及5’trailer區(qū)，經(jīng)融合PCR進(jìn)行融合后與原始載體pPolⅡ-BDV通過NgoMIV、SfiI酶切位點(diǎn)連接為pBR-LT；擴(kuò)增了綠色熒光蛋白（EGFP）的開放閱讀框并利用兩末端的ClaI、SphI酶切位點(diǎn)，將其反向插入到pBR-LT中，構(gòu)建了V4株微基因組pBR-EGFP。pBR-EGFP與輔助蛋白pCIneo-NP、pCIneo-P、pCIneo-NP以及負(fù)責(zé)產(chǎn)生T7聚合酶的質(zhì)粒pCAGG

7、S-T7共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，可見很強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，說明輔助質(zhì)粒及pCAGGS-T7均可正常工作；通過與pEGFP-N1對(duì)照做了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的效率約10％左右；而在pEGFP-N1單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到約40-50％，說明共轉(zhuǎn)染的效率較低；中發(fā)揮了一定作用。
　　 雖然最終經(jīng)過多次重復(fù)拯救實(shí)驗(yàn)，我們沒能獲得V4株的救獲病毒，但目前已完成的工作已為V4株反向遺傳體系的建立打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，在拯救體系及條件上進(jìn)行改進(jìn)

8、后，有望于近期拯救成功。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先通過蝕斑純化的方法對(duì)保存的V4毒株進(jìn)行了三輪純化，比較了不同克隆株問耐熱性及耐凍融性的差異，選擇了綜合性狀更優(yōu)良的克隆株；完成了該克隆株的全基因組序列的測(cè)定，分析了主要結(jié)構(gòu)蛋白NP、P、M、F、HN和L的基因序列，比較了與其他毒株的核苷酸、氨基酸同源性及進(jìn)化樹分類結(jié)果，表明保存的V4株是QV4株的傳代毒。構(gòu)建了三個(gè)全長(zhǎng)cDNA克隆，分別為T7啟動(dòng)子控制下的pFT7-final，Ⅱ型啟動(dòng)子