新城疫山東分離株的分離鑒定及F、HN基因的克隆與序列分析.pdf

1、新城疫(NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)引起的極易傳染的毀滅性疾病。NDV屬于副粘病毒科，副粘病毒亞科，腮腺炎病毒屬。由于該病發(fā)病急、致死率高，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，所以被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為A類烈性傳染病。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)普遍開(kāi)展了以接種疫苗為主的新城疫綜合防制措施，使得ND的暴發(fā)得以控制，但近年來(lái)，ND的流行又出現(xiàn)的新的特點(diǎn)：不表現(xiàn)特異性癥狀

2、的ND病例日益增多，甚至于高抗體雞群也發(fā)生該??；許多學(xué)者認(rèn)為這些流行特點(diǎn)表明很可能是由變異或超強(qiáng)毒株引起。特別是近年來(lái)鵝源病毒新城疫變異株的出現(xiàn)，更引起人們對(duì)于非典型新城疫發(fā)病原因的興趣。 本研究在對(duì)2004年從山東濰坊某雞場(chǎng)不表現(xiàn)典型ND癥狀的高抗體蛋雞中分離到的一株新城疫野毒株(暫命名：ShD-5-04)進(jìn)行生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增出其F和HN基因，并與標(biāo)準(zhǔn)株及其他5株山東分離株(HN基因)進(jìn)行同源性比較，為探討新城疫是

3、否發(fā)生變異提供理論依據(jù)。為山東省的NDV分子流行病學(xué)研究提供有益參考，豐富我國(guó)新城疫分子流行病學(xué)特征，為制定控制新城疫方法提供重要依據(jù)。本課題分四部分進(jìn)行研究。 第一部分：NDVShD-5-04株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究對(duì)從山東濰坊某雞場(chǎng)不表現(xiàn)典型ND癥狀的高抗體蛋雞中分離到的一株新城疫病毒(NDVShD-5-04)進(jìn)行了生物學(xué)特性研究。SPF雞胚接種培養(yǎng)后，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)鑒定，該分離株具有血凝性，且可被ND標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制和中和

4、，不能被AI(H5亞型與H9亞型)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制，表明該分離株為新城疫病毒。該病毒的最小致死量病毒致死雞胚的平均時(shí)間(MDT)為50.4h；1日齡SPF雞腦內(nèi)接種分離病毒致病指數(shù)(ICPI)為1.85；6周齡SPF雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)為2.42；血凝解脫快，血凝素?zé)岱€(wěn)定性差；回歸試驗(yàn)雞出現(xiàn)了新城疫癥狀和病變。由此，該病毒株確定屬于新城疫病毒強(qiáng)毒型。 第二部分：NDVShD-5-04株F基因

5、的克隆與序列分析本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出NDVShD-5-04株F基因全基因序列，并對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定和分析。參考國(guó)內(nèi)外已發(fā)表各新城疫代表株，繪制了NDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，分析其遺傳變異關(guān)系。結(jié)果表明：ShD-5-04株的F基因開(kāi)放性閱讀框架(ORF)為1662bp，編碼489個(gè)氨基酸。與國(guó)外發(fā)表的部分新城疫病毒強(qiáng)毒株和弱毒株之間相同序列進(jìn)行比較，F(xiàn)基因核苷酸序列的同源性在84.1％～88.7％之間，氨基

6、酸同源性在88.1％～93.3％之間；系統(tǒng)發(fā)育分析得出，該分離株為基因Ⅶ型；F蛋白裂解位點(diǎn)區(qū)(112～117)氨基酸組成與強(qiáng)毒株一致，從而從分子水平上說(shuō)明NDV山東分離株(ShD-5-04)為發(fā)生了一定程度變異的新城疫強(qiáng)毒株。 第三部分：NDVShD-5-04株HN基因的克隆與序列分析本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR法特異性的擴(kuò)增出新城疫山東分離株(ShD-5-04)的HN基因全基因序列，并對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定和分析。結(jié)果表明：ShD-

7、5-04株的HN基因開(kāi)放性閱讀框架(ORF)為1716bp，編碼571個(gè)氨基酸。根據(jù)HN的氨基酸同源性，NDV可分為A，B，C3群，分別含有616，577和571個(gè)氨基酸，一般A群為弱毒，C群為強(qiáng)毒，B群為弱毒株、中毒株、強(qiáng)毒株皆有。本研究中的分離毒HN基因，屬于C群，強(qiáng)毒株，這一點(diǎn)不僅與F蛋白裂解位點(diǎn)區(qū)分析屬于強(qiáng)毒結(jié)果一致，還與生物學(xué)特性中的毒力指標(biāo)也是相吻合的。與國(guó)外發(fā)表的部分新城疫病毒強(qiáng)毒株和弱毒株之間相同序列進(jìn)行比較，HN基因核

8、苷酸序列的同源性在82.1％～87.4％之間，氨基酸同源性在88.6％～90.9％之間。 第四部分：近五年間6株NDV山東分離株HN基因的克隆與序列分析用設(shè)計(jì)的特異性引物，通過(guò)RT-PCR法對(duì)1999至2004年間分離自山東省的具有一定代表性的6株雞新城疫病毒(編號(hào)ShD-1-02，ShD-2-04，ShD-3-99，ShD-4-03，ShD-5-04，ShD-6-01)進(jìn)行HN基因的擴(kuò)增和克隆，并對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定和分析。