枳葉片抑制差減雜交cDNA文庫構(gòu)建及PtrBAM1基因抗寒功能鑒定.pdf

1、低溫凍害嚴(yán)重制約著一些商業(yè)類柑橘果樹的種植和產(chǎn)量，而通過傳統(tǒng)的育種方法難以獲得耐低溫凍害的柑橘品種。遺傳改良可以彌補傳統(tǒng)育種之不足，但前提是獲得較好的低溫抗性基因。枳(Poncirus trifoliata(L.) Raf)屬于蕓香科枳屬，為柑橘種植時常用的砧木。完全低溫馴化后，枳可耐-26℃低溫，但是其耐寒分子和生理機(jī)制的研究還不是很明晰。本研究利用4℃和25℃處理的枳葉片為材料，通過SSH技術(shù)篩選了一批低溫應(yīng)答相關(guān)基因。在此基礎(chǔ)上，

2、對篩選的β-淀粉酶基因PtrBAM1及枳中β-淀粉酶其它家族成員進(jìn)行全長克隆，分析它們在不同脅迫及處理下的表達(dá)模式，并重點對PtrBAM1的抗寒功能進(jìn)行了鑒定。主要結(jié)果如下:
　　 1.用4℃和25℃處理3個月大的實生枳，取不同時間點(6 h，1d，3d，5d，7 d)的葉片提取RNA，將兩個溫度不同時間點的RNA分別混樣分離mRNA，構(gòu)建低溫SSH正向和反向文庫。兩個文庫差減效率較高，經(jīng)反Northern blotting驗證

3、，挑選差異表達(dá)兩倍以上的基因進(jìn)行測序和分析。正反向庫中各有188和180條序列成功測序，經(jīng)CAP3拼接后正向庫獲得106條序列（75個單序列和31個contigs），反向庫中獲得121條序列（98個單序列和23個contigs）。利用Blast2Go對篩選基因的分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞元件組分三方面進(jìn)行注釋分析。按分子功能分，正反庫都可分為7大類，最大兩類為催化和結(jié)合蛋白（正反庫中催化蛋白各占43％和39％，結(jié)合蛋白各占35％和36％

4、）;按生物學(xué)過程分，最大兩類為代謝和外界刺激相關(guān)（代謝相關(guān)正反庫中各占43％和45％，外界刺激各占9％和13％）;按細(xì)胞元件組分看，低溫下生物膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)都發(fā)生了改變。
　　 根據(jù)細(xì)胞膜保護(hù)、過量ROS清除、滲透平衡協(xié)調(diào)三個方面，從正反庫中各挑選了6個ESTs進(jìn)行半定量PCR驗證，進(jìn)一步驗證它們確實為低溫響應(yīng)相關(guān)基因。另外，低溫下枳葉片中總β-淀粉酶和GST的活性測定結(jié)果表明，它們活性的變化都與表達(dá)水平

5、相符。
　　 2.在SSH文庫篩選出(一)β-淀粉酶基因(BAM)片段的基礎(chǔ)上，利用RACE克隆了其全長，命名為PtrBAM1，利用同源序列法依次獲得該家族其它7個基因的全長，命名為PtrBAM2-8。通過序列比對和基因結(jié)構(gòu)可將PtrBAMs分為4大類，Ⅰ類包括PtrBAM5;Ⅱ類包括PtrBAM1-3和PtrBAM8;Ⅲ類包括PtrBAM4;Ⅳ類包括PtrBAM6、7。根據(jù)序列比對和前人的研究，推測PtrBAM1可能在枳葉片淀

6、粉降解中起決定性的作用，而PtrBAM6和PtrBAM7可能具有轉(zhuǎn)錄因子的特性。在低溫、脫水、NaCl、麥芽糖等不同處理下，PtrBAM1-8之間的表達(dá)不盡相同，說明該基因家族個成員所行使的生理功能可能也會不同。
　　 3.淀粉染色實驗和透射電鏡觀察結(jié)果顯示PtrBAM1超表達(dá)煙草的三個轉(zhuǎn)基因株系(F6、F11、F25)淀粉積累明顯少于Nud野生型和1301空載系，而RNAi檸檬的兩個系（bam1 L1和L2）淀粉積累明顯多于對

7、照;同時，在正常情況下超表達(dá)煙草中β-淀粉酶活性、麥芽糖和可溶性糖含量都高于對照，說明PtrBAM1確實有水解淀粉的生理活性。-4℃凍害1h后常溫恢復(fù)3d，超表達(dá)株系都可以恢復(fù)正常生長，而Nud和1301系絕大部分植株都枯萎死亡。在2℃低溫處理下，超表達(dá)系的EL和MDA含量、O2-和H2O2積累都顯著性低于對照。因為整個低溫處理過程中超表達(dá)系的β-淀粉酶活性、麥芽糖和可溶性糖含量都高于對照（5d除外），說明PtrBAM1超表達(dá)可能通過增