枳葉片抑制差減雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建及PtrBAM1基因抗寒功能鑒定.pdf

1、低溫凍害嚴(yán)重制約著一些商業(yè)類柑橘果樹(shù)的種植和產(chǎn)量，而通過(guò)傳統(tǒng)的育種方法難以獲得耐低溫凍害的柑橘品種。遺傳改良可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種之不足，但前提是獲得較好的低溫抗性基因。枳(Poncirus trifoliata(L.) Raf)屬于蕓香科枳屬，為柑橘種植時(shí)常用的砧木。完全低溫馴化后，枳可耐-26℃低溫，但是其耐寒分子和生理機(jī)制的研究還不是很明晰。本研究利用4℃和25℃處理的枳葉片為材料，通過(guò)SSH技術(shù)篩選了一批低溫應(yīng)答相關(guān)基因。在此基礎(chǔ)上，

2、對(duì)篩選的β-淀粉酶基因PtrBAM1及枳中β-淀粉酶其它家族成員進(jìn)行全長(zhǎng)克隆，分析它們?cè)诓煌{迫及處理下的表達(dá)模式，并重點(diǎn)對(duì)PtrBAM1的抗寒功能進(jìn)行了鑒定。主要結(jié)果如下:
　　 1.用4℃和25℃處理3個(gè)月大的實(shí)生枳，取不同時(shí)間點(diǎn)(6 h，1d，3d，5d，7 d)的葉片提取RNA，將兩個(gè)溫度不同時(shí)間點(diǎn)的RNA分別混樣分離mRNA，構(gòu)建低溫SSH正向和反向文庫(kù)。兩個(gè)文庫(kù)差減效率較高，經(jīng)反Northern blotting驗(yàn)證

3、，挑選差異表達(dá)兩倍以上的基因進(jìn)行測(cè)序和分析。正反向庫(kù)中各有188和180條序列成功測(cè)序，經(jīng)CAP3拼接后正向庫(kù)獲得106條序列（75個(gè)單序列和31個(gè)contigs），反向庫(kù)中獲得121條序列（98個(gè)單序列和23個(gè)contigs）。利用Blast2Go對(duì)篩選基因的分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞元件組分三方面進(jìn)行注釋分析。按分子功能分，正反庫(kù)都可分為7大類，最大兩類為催化和結(jié)合蛋白（正反庫(kù)中催化蛋白各占43％和39％，結(jié)合蛋白各占35％和36％

4、）;按生物學(xué)過(guò)程分，最大兩類為代謝和外界刺激相關(guān)（代謝相關(guān)正反庫(kù)中各占43％和45％，外界刺激各占9％和13％）;按細(xì)胞元件組分看，低溫下生物膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)都發(fā)生了改變。
　　 根據(jù)細(xì)胞膜保護(hù)、過(guò)量ROS清除、滲透平衡協(xié)調(diào)三個(gè)方面，從正反庫(kù)中各挑選了6個(gè)ESTs進(jìn)行半定量PCR驗(yàn)證，進(jìn)一步驗(yàn)證它們確實(shí)為低溫響應(yīng)相關(guān)基因。另外，低溫下枳葉片中總β-淀粉酶和GST的活性測(cè)定結(jié)果表明，它們活性的變化都與表達(dá)水平

5、相符。
　　 2.在SSH文庫(kù)篩選出(一)β-淀粉酶基因(BAM)片段的基礎(chǔ)上，利用RACE克隆了其全長(zhǎng)，命名為PtrBAM1，利用同源序列法依次獲得該家族其它7個(gè)基因的全長(zhǎng)，命名為PtrBAM2-8。通過(guò)序列比對(duì)和基因結(jié)構(gòu)可將PtrBAMs分為4大類，Ⅰ類包括PtrBAM5;Ⅱ類包括PtrBAM1-3和PtrBAM8;Ⅲ類包括PtrBAM4;Ⅳ類包括PtrBAM6、7。根據(jù)序列比對(duì)和前人的研究，推測(cè)PtrBAM1可能在枳葉片淀

6、粉降解中起決定性的作用，而PtrBAM6和PtrBAM7可能具有轉(zhuǎn)錄因子的特性。在低溫、脫水、NaCl、麥芽糖等不同處理下，PtrBAM1-8之間的表達(dá)不盡相同，說(shuō)明該基因家族個(gè)成員所行使的生理功能可能也會(huì)不同。
　　 3.淀粉染色實(shí)驗(yàn)和透射電鏡觀察結(jié)果顯示PtrBAM1超表達(dá)煙草的三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(F6、F11、F25)淀粉積累明顯少于Nud野生型和1301空載系，而RNAi檸檬的兩個(gè)系（bam1 L1和L2）淀粉積累明顯多于對(duì)

7、照;同時(shí)，在正常情況下超表達(dá)煙草中β-淀粉酶活性、麥芽糖和可溶性糖含量都高于對(duì)照，說(shuō)明PtrBAM1確實(shí)有水解淀粉的生理活性。-4℃凍害1h后常溫恢復(fù)3d，超表達(dá)株系都可以恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而Nud和1301系絕大部分植株都枯萎死亡。在2℃低溫處理下，超表達(dá)系的EL和MDA含量、O2-和H2O2積累都顯著性低于對(duì)照。因?yàn)檎麄€(gè)低溫處理過(guò)程中超表達(dá)系的β-淀粉酶活性、麥芽糖和可溶性糖含量都高于對(duì)照（5d除外），說(shuō)明PtrBAM1超表達(dá)可能通過(guò)增