無(wú)患子葉片cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及EST分析.pdf

1、無(wú)患子（Sapindus mukorossi），作為集觀賞、藥用、材用和生態(tài)公益林樹(shù)種于一體的優(yōu)良樹(shù)種，無(wú)患子的開(kāi)發(fā)利用越來(lái)越受到大家的重視。本研究通過(guò)對(duì)三種提取RNA方法進(jìn)行比較，得到最適合提取無(wú)患子葉片總RNA的方法，同時(shí)建立了無(wú)患子葉片cDNA文庫(kù)并對(duì)EST片段進(jìn)行初步分析。主要結(jié)果如下：
　　1、以無(wú)患子幼嫩葉片為材料，比較了CTAB法、RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒法、Trizol法三種RNA提取方法的提

2、取效果。試驗(yàn)表明：CTAB法在三中種方法中是最不適合的，因?yàn)橛蠨NA的污染，而且RNA的濃度很??；天根試劑盒法的優(yōu)點(diǎn)是RNA的濃度和純度方面都很好，沒(méi)有蛋白質(zhì)等有機(jī)物和鹽類(lèi)等無(wú)機(jī)物的干擾，但是由于其提取的過(guò)程太過(guò)繁瑣，使得RNA的完整性不夠完美，稍有降解；Trizol法是最適合的方法，RNA的完整性很好，但是由于Trizol試劑成分的影響，胍類(lèi)等無(wú)機(jī)鹽成分殘留太多，不利于后面實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，所以進(jìn)行純化處理，處理后結(jié)果符合構(gòu)建cDNA文庫(kù)的

3、要求。
　　2、使用完整性好的高質(zhì)量 RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA，通過(guò) CHROMA SPIN+TE-1000柱收集片段>500bp片段與載體pSMART2IFD Linearized Vector連接，最后用電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了無(wú)患子葉片的cDNA文庫(kù)。最終得到原始文庫(kù)的滴度為2.9×106 cfu·mL-1，符合建庫(kù)的要求。文庫(kù)的重組率為91.4％，插入片段的長(zhǎng)度在0.3-1.5bp之間，擴(kuò)增文庫(kù)的滴度為5.64×1

4、07 cfu·mL-1。
　　3、從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取253個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，得到有效序列224條，經(jīng)過(guò)DNAMAN軟件編輯后，共有115393個(gè)堿基，其中GC堿基含量占總堿基數(shù)的48.9%，平均長(zhǎng)度為515.15bp。利用DNAstar軟件中的Seqman程序?qū)?24個(gè)序列進(jìn)行片段重疊群分析和拼接后得到89個(gè)contigs，其中包含41個(gè)singlets，文庫(kù)冗余度為60.27%。89個(gè)contigs中，高豐度基因5個(gè)，中豐度

5、基因43個(gè)，低豐度基因41個(gè)，分別占總數(shù)的5.62%，48.31%，46.07%。
　　4、89個(gè)contigs通過(guò)Blast2GO上的blast得到同源性序列62條，其中高度同源序列為39條，占總數(shù)的43.82%。剩余的26條中有17條通過(guò)NCBI的blastn程序可以比對(duì)到核酸，但其分值及相似度不滿足同源性要求，剩余9條未檢索到結(jié)果。有功能注釋的序列占47條。
　　5、對(duì)EST序列進(jìn)行物種相似性分析，得到相似序列大部分物

6、種為植物，不過(guò)也有動(dòng)物，這也反映出生物界的物種之間存在著一定的關(guān)聯(lián)性。沒(méi)有檢索到與無(wú)患子相似，由此可以看出無(wú)患子的相關(guān)研究還很薄弱。
　　6、利用Blast2GO對(duì)47條EST序列進(jìn)行GO功能注釋?zhuān)Y(jié)果表明：三大功能分類(lèi)的基因大致上都有，這不僅為后續(xù)的大規(guī)模測(cè)序的可行性提供了理論上的證據(jù)，同時(shí)也為未來(lái)的研究提供了必要的線索。此外，通過(guò)GO level分析得出：47條獲得GO注釋的序列中每條序列都至少得到一個(gè)GO術(shù)語(yǔ)，總共獲得注釋的