利用抑制性差減雜交研究早實枳成花轉(zhuǎn)變的分子機(jī)理.pdf

1、柑橘是世界上栽培最多的果樹之一,我國柑橘的栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。開花是果實形成的基礎(chǔ),解析花形成與發(fā)育的分子機(jī)制對于加速果樹育種具有重要的意義。柑橘類植物的童期很長,實生苗通常需要6-8年才能開花。1976年在我國湖北宜昌發(fā)現(xiàn)了一棵來自普通枳的短童期早花變異,在播種一年后就有20％的植株開花,第三年100％的植株開花:同時該變異與普通枳一年一次的開花習(xí)性不同,可以一年開花2-3次。早實枳與普通枳開花性狀的顯著差異,為研究柑橘花發(fā)育

2、的分子機(jī)理提供了寶貴的材料。本研究以早實枳和普通枳為材料,通過抑制性差減雜交(SSH)和反向Northern的方法,對早實枳早花的分子機(jī)理進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下:
　　 1.通過抑制性差減雜交和反向Northern鑒定了早實枳童期與成年期兩個不同發(fā)育時期差異表達(dá)的基因,在童期差減的cDNA文庫中,共分離到190個與成花誘導(dǎo)、花發(fā)育和開花相關(guān)的ESTs,并通過熒光定量和原位雜交的方法檢測分析了4個差異表達(dá)ESTs的時空表達(dá)模式并

3、證明其與早實枳成花密切相關(guān)。
　　 2.按照上述同樣方法,在成年期差減文庫中,分離獲得了178個差異表達(dá)的ESTs:其中Y3E4克隆與擬南芥的EARLY FLOWERING5(ELFS)呈現(xiàn)出很高的同源性,實時定量和原位雜交對該基因的時空表達(dá)模式進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)模式與早實枳的成花誘導(dǎo)和花發(fā)育過程密切相關(guān):通過 RACE方法獲得了該基因的全長cDNA；并通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化了擬南芥,結(jié)果表明該基因在長日照條件下能夠促使擬南芥提

4、早開花,這種功能特征與擬南芥中的ELF5相反,表明木本植物中的ELF5的功能與草本植物的同源基因在進(jìn)化的過程中可能發(fā)生了分化。
　　 3.另一方面,為了分離早實枳和普通枳差異表達(dá)的基因,分別構(gòu)建了童期階段正、反向的SSH文庫,通過斑點雜交分別在正向和反向的差減文庫中分離到149個和125個差異表達(dá)的ESTs。通過生物信息學(xué)分析篩選開花相關(guān)的ESTs,從中選取6個成花調(diào)控途徑中的節(jié)點基因進(jìn)行原位雜交和實時定量分析,結(jié)果表明BARE

5、LYANYMERITED,FLOWERING LOCUST和TERMINAL FLOWERI可能在早實枳成花轉(zhuǎn)變中起重要作用。
　　 4.TERMINAL FLOWER1(TFL1)/CENTRORADIALIS(CEN)同源基因是擬南芥花分生組織發(fā)育過程中的一類關(guān)鍵基因,決定開花的時間。本研究從早實枳中分離到了兩個TFL1/CEN的同源基因PtTFL1和PtTFL2,利用實時定量檢測了它們在成年期和童期的表達(dá)情況,結(jié)果表明這兩

6、個基因與早實枳的營養(yǎng)生長和自剪密切相關(guān)；原位雜交也證明這兩個基因主要在營養(yǎng)組織中表達(dá)；擬南芥超表達(dá)PtTFL1和PtTFL2表現(xiàn)為延遲開花,表明TFLI/CEN家族基因在不同物種中功能是保守的。
　　 5.在需要低溫春化生態(tài)型的擬南芥中,開花抑制基因FLC是調(diào)控開花的關(guān)鍵基因。在本研究構(gòu)建的童期差減文庫中,分離到一個與擬南芥的FLOWERINGLOCUS C(FLC)高度同源的EST,通過文庫與RACE結(jié)合的方法分離獲得該基因的

7、全長,進(jìn)化分析表明這個基因與擬南芥FLC聚類到一個分支,與FLC的分化距離短于其他任何一個MADS基因間的距離。實時定量分析表明PtFLC在早實枳中冬季低溫季節(jié)表達(dá)量高、春季和夏季表達(dá)量低。原位雜交結(jié)果顯示該基因是廣泛表達(dá)基因,在營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段都能檢測到該基因的表達(dá),表明該基因參與了營養(yǎng)生長與生殖生長的不同代謝過程,其表達(dá)量的變化與階段發(fā)育轉(zhuǎn)變有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn),PtFLC在早實枳的不同發(fā)育階段存在選擇性剪切的調(diào)控方式,共分

8、離得到5個選擇性剪切的轉(zhuǎn)錄本在本研究,其中PtFLC1和PtFLC2調(diào)控童期的發(fā)育,PtFLC4和PtFLC5調(diào)控成年期的發(fā)育,PtFLC3調(diào)控整個發(fā)育階段,這一現(xiàn)象與草本植物中FLC的調(diào)控方式不同,因此我們推測,在木本植物中FLC的功能發(fā)生了分化,可能通過剪切的方式參與了木本植物芽的休眠、階段發(fā)育的轉(zhuǎn)化和花的形成等發(fā)育過程。
　　 6.通過轉(zhuǎn)錄組分析,分別從早實枳和普通枳得到31,468和29,864條unigene,去重后共