巖溪晚蘆成熟果皮與果肉差減cDNA文庫的構(gòu)建及初步分析.pdf

1、我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，已成為世界第二大柑橘生產(chǎn)國。然而長期以來，我國柑橘品種早、中、晚熟熟期搭配不合理、晚熟品種偏少的問題一直未能得到有效的解決，國產(chǎn)柑橘每年有半年的空檔期，國外則乘虛而入，逐漸占領柑橘類水果的高端市場。因此，如何實現(xiàn)國產(chǎn)柑橘鮮果周年均衡供應頗為重要。 巖溪晚蘆(Citrus reticulata)是我國從普通槿柑選出的晚熟變異品種，相同條件下，其成熟期比普通椪柑遲40-60天，果實品質(zhì)優(yōu)良，耐寒性較強。巖溪晚蘆

2、果實成熟過程中，果皮和果肉必然有著各自不同的內(nèi)在作用機理，受其自身一系列基因的表達與調(diào)控作用。有效發(fā)掘與其外觀和內(nèi)質(zhì)相關(guān)的優(yōu)異基因具有十分重要的意義。 本研究以椏柑成熟果皮為材料，利用抑制性差減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)，富集椪柑果皮和果肉的差異表達基因，構(gòu)建了巖溪晚蘆果皮與果肉的差減cDNA文庫，通過對文庫篩選、克隆測序和功能分析，發(fā)掘與其外觀和內(nèi)質(zhì)相關(guān)的優(yōu)異

3、基因，以便為今后進一步的基因功能分析、全長基因克隆及基因改造等研究打下基礎。 分別以成熟椏柑果肉作為抑制性差減文庫的實驗材料(Driver)、以成熟果皮作為抑制性差減文庫的材料(Tester)，采用自行改進的LiCl沉淀法，分別提取以上兩種材料的總RNA，按照Oligotex mRNA Mini Kit試劑盒操作分離純化mKNA，獲得了高質(zhì)量的mRNA。采用SSH試劑盒操作方法進行抑制性差減雜交，先將兩種材料mRNA行反轉(zhuǎn)錄成雙

4、鏈cDNA，經(jīng)Rsa Ⅰ酶切，再將Tester酶切產(chǎn)物分成兩份：一份與Adoptorl連接，另一份與Adoptor2R連接；將抑制性差減雜交第二次PCR的產(chǎn)物純化后連接至pTZ57R/T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 a感受態(tài)細胞，經(jīng)藍向斑篩選、培養(yǎng)，用T/A克隆法，DH5 α為受體菌，菌斑經(jīng)統(tǒng)計共9784個，其中藍斑87個，差減文庫重組率達99.1％。構(gòu)建了庫容量為1019個克隆的差減cDNA文庫。隨機對文庫中100個白色克隆抽提質(zhì)粒后檢測，有

5、96個陽性克隆均能檢測到明顯的條帶，插入片段長度集中在100～500bp，與預期插入片段相一致。隨機挑選了770個克隆進行測序，成功測出411個EST，其中有377個與已知基因具有較高的相似性，它們分屬126個基因，其中1個基因出現(xiàn)頻率最高達31次，為假想的一種蛋白；1個基囚出現(xiàn)頻率達28次，為未命名的蛋白產(chǎn)物；1個基岡出現(xiàn)頻率達25次，為假想的葉綠體RF1；5個基因出現(xiàn)頻率在10～20之間；55個基因出現(xiàn)頻率在2～1之間，其中大部分集

6、中在2～5之間；63個基因只出現(xiàn)1次。文庫中，低拷貝基因和高拷貝基因同時存在。這些基因涉及到了色素合成、能量代謝、初級代謝、次生代謝、抗逆防御、蛋白代謝、信號轉(zhuǎn)導、香味形成、果皮軟化(衰老)、精油代謝、抗氧化代謝、澀味消失以及結(jié)構(gòu)、運動、基因表達等等生理生化過程，大多均為果皮組織特異表達基因。另外還有涉及到澀味變化、三價鐵螯合物、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子gag蛋白、查爾酮、硼離子轉(zhuǎn)運、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶等功能的基因。功能已知且不重復的EST共有6