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文檔簡介
1、我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛,已成為世界第二大柑橘生產(chǎn)國。然而長期以來,我國柑橘品種早、中、晚熟熟期搭配不合理、晚熟品種偏少的問題一直未能得到有效的解決,國產(chǎn)柑橘每年有半年的空檔期,國外則乘虛而入,逐漸占領柑橘類水果的高端市場。因此,如何實現(xiàn)國產(chǎn)柑橘鮮果周年均衡供應頗為重要。 巖溪晚蘆(Citrus reticulata)是我國從普通槿柑選出的晚熟變異品種,相同條件下,其成熟期比普通椪柑遲40-60天,果實品質(zhì)優(yōu)良,耐寒性較強。巖溪晚蘆
2、果實成熟過程中,果皮和果肉必然有著各自不同的內(nèi)在作用機理,受其自身一系列基因的表達與調(diào)控作用。有效發(fā)掘與其外觀和內(nèi)質(zhì)相關(guān)的優(yōu)異基因具有十分重要的意義。 本研究以椏柑成熟果皮為材料,利用抑制性差減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization,SSH),富集椪柑果皮和果肉的差異表達基因,構(gòu)建了巖溪晚蘆果皮與果肉的差減cDNA文庫,通過對文庫篩選、克隆測序和功能分析,發(fā)掘與其外觀和內(nèi)質(zhì)相關(guān)的優(yōu)異
3、基因,以便為今后進一步的基因功能分析、全長基因克隆及基因改造等研究打下基礎。 分別以成熟椏柑果肉作為抑制性差減文庫的實驗材料(Driver)、以成熟果皮作為抑制性差減文庫的材料(Tester),采用自行改進的LiCl沉淀法,分別提取以上兩種材料的總RNA,按照Oligotex mRNA Mini Kit試劑盒操作分離純化mKNA,獲得了高質(zhì)量的mRNA。采用SSH試劑盒操作方法進行抑制性差減雜交,先將兩種材料mRNA行反轉(zhuǎn)錄成雙
4、鏈cDNA,經(jīng)Rsa Ⅰ酶切,再將Tester酶切產(chǎn)物分成兩份:一份與Adoptorl連接,另一份與Adoptor2R連接;將抑制性差減雜交第二次PCR的產(chǎn)物純化后連接至pTZ57R/T載體中,轉(zhuǎn)化到DH5 a感受態(tài)細胞,經(jīng)藍向斑篩選、培養(yǎng),用T/A克隆法,DH5 α為受體菌,菌斑經(jīng)統(tǒng)計共9784個,其中藍斑87個,差減文庫重組率達99.1%。構(gòu)建了庫容量為1019個克隆的差減cDNA文庫。隨機對文庫中100個白色克隆抽提質(zhì)粒后檢測,有
5、96個陽性克隆均能檢測到明顯的條帶,插入片段長度集中在100~500bp,與預期插入片段相一致。隨機挑選了770個克隆進行測序,成功測出411個EST,其中有377個與已知基因具有較高的相似性,它們分屬126個基因,其中1個基因出現(xiàn)頻率最高達31次,為假想的一種蛋白;1個基囚出現(xiàn)頻率達28次,為未命名的蛋白產(chǎn)物;1個基岡出現(xiàn)頻率達25次,為假想的葉綠體RF1;5個基因出現(xiàn)頻率在10~20之間;55個基因出現(xiàn)頻率在2~1之間,其中大部分集
6、中在2~5之間;63個基因只出現(xiàn)1次。文庫中,低拷貝基因和高拷貝基因同時存在。這些基因涉及到了色素合成、能量代謝、初級代謝、次生代謝、抗逆防御、蛋白代謝、信號轉(zhuǎn)導、香味形成、果皮軟化(衰老)、精油代謝、抗氧化代謝、澀味消失以及結(jié)構(gòu)、運動、基因表達等等生理生化過程,大多均為果皮組織特異表達基因。另外還有涉及到澀味變化、三價鐵螯合物、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子gag蛋白、查爾酮、硼離子轉(zhuǎn)運、兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶等功能的基因。功能已知且不重復的EST共有6
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