香蕉果實(shí)炭疽菌潛伏侵染香蕉果實(shí)抑制差減cDNA文庫的構(gòu)建.pdf

1、本研究旨在分離香蕉果實(shí)炭疽病病程相關(guān)的特異表達(dá)的基因，進(jìn)而推斷這些基因在香蕉果實(shí)炭疽病發(fā)病過程中的作用。本實(shí)驗(yàn)總共分離和接種了50個炭疽菌菌株，從中篩選獲得了香蕉果實(shí)炭疽菌(Colletotrichummusae)強(qiáng)致病菌株F1。對七到八成熟度的無炭疽菌侵染的巴西蕉果接種炭疽菌F1為處理組，同時以接種空白培養(yǎng)基為對照組。結(jié)果是接種炭疽菌3d未見病斑，5d病斑出現(xiàn)，7d病斑明顯。本實(shí)驗(yàn)選取接種炭疽菌5d后病斑出現(xiàn)的香蕉果皮為Tester和

2、對應(yīng)天數(shù)的對照組為Driver，進(jìn)行抑制差減雜交。用T/A法分別構(gòu)建正向差減文庫(含4780個克隆)和反向差減文庫(含3600個克隆)。采用PCR方法篩選正向差減文庫獲得266個重組子，隨機(jī)挑選70個重組子的cDNA插入片段進(jìn)行了序列測定，并對它們進(jìn)行Blastn，Blastx同源性比較。 結(jié)果表明：7個cDNA序列與數(shù)據(jù)庫中功能未知的核酸序列的同源性達(dá)60-90％，約占14％；28個cDNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與功能已知的c

3、DNA推導(dǎo)出的氨基酸序列同源性達(dá)60-90％(比較的核酸長度均在200bp以上)，約占54％，另外還獲得未被報道過的cDNA片段5個，約為10％，它們可能代表新基因。 為了進(jìn)一步了解功能推測的克隆片段有哪些涉及到抗病與防御相關(guān)基因，從克隆片段的BLASTn和BLASTx比較結(jié)果可以得出，29個克隆片段與抗病防御相關(guān)，包括幾丁質(zhì)酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、異黃酮還原酶相關(guān)蛋白、富含亮氨酸重復(fù)序列、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸輔酶、類受體激

4、酶等，這些化合物參與了抗病反應(yīng)的基本過程。 對其中克隆號為T12、T710、T718、T15的cDNA片段進(jìn)行Northern雜交證明分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因在被接種炭疽菌侵染前沒有表達(dá)，侵染后的表達(dá)量均有不同程度的提高。同時說明所克隆到的差異表達(dá)的cDNA片段確實(shí)是香蕉基因組所編碼的，并且是接種炭疽菌后菌絲與果皮開始互作時到5d病斑出現(xiàn)這一病程表達(dá)的。另外，揭示這些基因在病原與寄主互作中起著不同的作用。從而也證實(shí)了SSH中獲得的