西洋參根cDNA文庫(kù)構(gòu)建及鑒定.pdf

1、西洋參作為一種傳統(tǒng)中藥已有許多年的歷史，近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)西洋參化學(xué)、藥理及臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，證實(shí)其次生代謝物人參皂甙是西洋參生理活性最重要的有效成份，其藥理作用十分廣泛，有抗腫瘤、抗衰老、抗心律失常、抑制細(xì)胞凋亡、降糖降脂、改善學(xué)習(xí)記憶、增強(qiáng)免疫功能和解酒等多方面的作用。目前為止，關(guān)于西洋參藥理作用的報(bào)道已有許多，但關(guān)于西洋參有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控的基礎(chǔ)研究相對(duì)缺乏。為了探討西洋參有效成份的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理，保

2、存西洋參的資源信息庫(kù)，構(gòu)建了西洋參根組織全長(zhǎng)cDNA表達(dá)文庫(kù)。并對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行了初步鑒定。 本實(shí)驗(yàn)以西洋參根為研究材料，用Trizol方法提取西洋參根組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，長(zhǎng)距離PCR方法合成雙鏈cDNA;PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K水解、純化后，用SfiI酶切；將酶切產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離，回收0.4kb以上的cDNA組分，并與λTriplEx2載體連接；連接產(chǎn)物經(jīng)體外蛋白包裝，產(chǎn)生原始文庫(kù)；鑒定文庫(kù)的滴度和重組效率后，進(jìn)

3、行文庫(kù)擴(kuò)增。隨機(jī)挑取16個(gè)噬菌斑，用載體克隆位點(diǎn)兩端的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的質(zhì)量。經(jīng)測(cè)定該文庫(kù)初始滴度為4.03×107pfu/ml，擴(kuò)增后滴度為1.75×109pfu/ml，重組率為86％。插入片段長(zhǎng)度為0.3～2.0kb。同時(shí)，由于反轉(zhuǎn)錄過程中采用附加序列的方法使全長(zhǎng)mRNA得到反轉(zhuǎn)錄，所以得到的cDNA是完整的，完全符合cDNA文庫(kù)的要求。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了西洋參根組織的cDNA文庫(kù)。 從文庫(kù)