牛結核病特異抗體間接ELISA檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文牛結核病特異抗體間接ELISA檢測方法的建立及初步應用姓名：張桂榮申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：陳煥春;譚亞娣20060601牛結核病特異抗體問接E L I S A 檢測方法的建立及初步應用摘要牛結核病主要是由牛分枝桿菌( M y c o b a c t e r i u mb o v i s ) 弓l 起的一種人獸共患傳染病。該病呈慢性經(jīng)過，主要經(jīng)呼吸道和經(jīng)口感染。排菌的重癥病牛是本病的主要傳染源。

2、該病在世界各國都有發(fā)生，尤其是近年來，隨著結核菌耐藥菌株的產(chǎn)生及個體養(yǎng)牛戶的增加，牛結核病的疫情呈逐年上升趨勢。該病的傳播流行給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，至今牛結核病所造成的損失大于牛的其他各種疾病所造成損失的總和。同時由于牛結核病也可傳染給人，從而給人類公共衛(wèi)生安全造成了嚴重隱患，因此采取一切措施防治牛結核病刻不容緩。由于目前牛結核病沒有有效的疫苗進行預防，許多國家主要采用不免疫，加強檢疫，陽性牛一律撲殺的原則來實現(xiàn)牛結核病的控制

3、。因此準確而及時的診斷方法對于該病的防治顯得尤為重要。目前對于牛結核病的檢測，世界動物衛(wèi)生組織( O f f i c e I n t e r n a t i o n a l D e sE p i z o o t i e s ，0 I E ) 唯一推薦的方法是牛型結核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應( T u b e r c u l i n s k i nt e s t ，T S T ) ，但該方法存在嚴重的非特異性反應及對重癥牛的低反應力。結核菌素純化

4、蛋白衍化物( P r o t e i np u r i f i e dd e r i v a t i v e 。P P D ) 用于間接酶聯(lián)免疫吸附方法( E n z y m e ．1 i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y s ，E L I S A ) 檢測結核抗體也被嘗試過，但由于P P D 是一種成分復雜的蛋白混合物，除了含有牛分技桿菌特異性分泌抗原外，還含有許多其他分枝桿菌具有的

5、類屬抗原，因此交叉反應無法避免，而且早期感染牛多數(shù)抗體水平較低。鑒于以上情況，探索一種特異、敏感的檢疫方法是控制牛結核病的當務之急。M P B 7 0 、M P B 8 3 、C F P I O 和E s A l ：6 是牛分枝桿菌特異性抗原，許多研究已經(jīng)證實是非常有前景的鑒別診斷候選抗原。本研究采用這四種抗原建立了檢測牛結核病的間接E L I S A 方法，旨在為臨床結核病的診斷提供一種特異性，敏感性和實用性都比較理想的診斷試劑，為我

6、國牛結核病的防控提供技術支持。主要研究內(nèi)容包括：1 ．P P D ．E L I S A 方法的優(yōu)化本研究在前人工作的基礎上對P P D ．E L I S A 的封閉液，血清稀釋液，酶標二抗稀釋液，底物作用時間，終止液的選擇及陰陽判定等方面作了改進。改進后的E L I S A陰性背景降低，血清稀釋液簡化，酶標二抗利用效率提高，結果判定更加科學。2 ．E L I S A 檢測牛奶中結核病抗體的探討保存期試驗顯示，牛奶樣品在4 “ C 放7

7、d ，- 2 0 ℃存放1 5 d 以上不影響E L I S A 檢測結果．但牛奶反復凍融對抗體效價影響很大。E L I S A 檢測牛奶與檢測血清比較，兩者有9 0 ．8 ％的符合。3 ．牛結核特異性抗體E L I S A 檢測方法的建立借鑒優(yōu)化后的P P D ．E L I S A 程序，分別建立了C F P I O ．E S A l b E L I s A 、M P B 7 0 ．E L I S A 和M P B 8 3 ．E L