對蝦的病毒檢測及IHHNV夾心ELISA檢測方法的建立.pdf

1、20世紀80年代，全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)進入了鼎盛時期，對蝦養(yǎng)殖逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧s化養(yǎng)殖模式。由于對蝦養(yǎng)殖密度高，防治技術(shù)相對落后，導致對蝦病毒性疾病的廣泛暴發(fā)，使對蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大沖擊。近年來我國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)依然受到諸如對蝦白斑綜合征（White Spot Disease，WSD）、傳染性皮下及造血組織壞死?。↖nfectiousHypodermal and Hematopoietic Necrosis，IHHN）和桃拉綜合征(Taura Sy

2、ndrome，TS)等傳統(tǒng)病毒性疾病的威脅。這三種對蝦病毒性疾病均具有傳播速度快、發(fā)病率高、致死率高的特點，致使感染三種病毒的對蝦品質(zhì)和產(chǎn)量均明顯下降，對蝦養(yǎng)殖經(jīng)濟效益損失嚴重。目前，對蝦病毒性疾病的特效藥仍屬于研究瓶頸，因此檢測和防控是對蝦健康養(yǎng)殖的主要手段。
　　本文對2012年9月-2014年9月江蘇、安徽和廣東地區(qū)的348尾養(yǎng)殖對蝦進行了白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）、傳染性

3、皮下及造血組織壞死病毒（Infectious Hypodermal and Hematopoietie Necrosis Virus，IHHNV）和桃拉綜合征病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)的檢測，分別應用套式PCR、一步PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR方法。比對WSSV-TH、WSSV-CN、WSSV-TW和9株實驗室分離的WSSVORF14/15序列，建立系統(tǒng)進化樹，分析同源性和差異性。擴增IHHNV ORF3基因序列，

4、使用生物信息學軟件分析一株南京分離病毒的疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、抗原表位、糖基化及磷酸化位點，與IHHNV-HI，IHHNV-CA，IHHNV-FJ，IHHNV-TH，IHHNV-TW和IHHNV-EC比對，建立系統(tǒng)進化樹。構(gòu)建pET32a-ORF3重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)進行大量表達，純化pET32a-ORF3融合蛋白。以融合蛋白為抗原分別免疫ICR小鼠和新西蘭白兔，獲得小鼠血清和兔血清，純化血清獲得

5、鼠源多克隆抗體IgG和兔源多克隆抗體IgG。使用鼠源多克隆抗體和兔源多克隆抗體建立IHHNV夾心ELISA法。
　　江蘇、安徽和廣東地區(qū)WSSV陽性率為15.31％，IHHNV陽性率為4.31％，未檢出TSV。WSSV ORF14/15基因序列分析發(fā)現(xiàn)，9株WSSV可分為2大分支:分支1包括BA、BC、BE、BK、BI;分支2包括AG、SW、PH、JX。兩個分支之間差異率在60％-80％,說明兩個分支間的親緣關(guān)系較遠。
　　

6、IHHNV生物信息學分析結(jié)果表明，ORF3基因序列長度為990bp，編碼329個氨基酸，編碼蛋白親水性強，二級結(jié)構(gòu)含有55.9％的α-螺旋、52.0％的β-折疊以及13.4％的β-轉(zhuǎn)角，抗原表位分布較廣泛、抗原性強，不存在潛在的N-糖基化位點，存在13個潛在的O-糖基化位點和17個潛在的磷酸化位點，符合衣殼蛋白特征。進化樹結(jié)果表明，IHHNV-NJ株的ORF3基因編碼蛋白序列與6株IHHNV序列同源性均高于96％，說明IHHNV ORF