牛結(jié)蛋白基因啟動(dòng)子的改造及其功能分析.pdf

1、研制出肉質(zhì)優(yōu)良并且高產(chǎn)量的家畜一貫是我們畜牧生產(chǎn)所尋求的目標(biāo)。傳統(tǒng)的雜交育種存在諸多問題，例如周期長，效率低，易變異等。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可在短期內(nèi)培育出優(yōu)質(zhì)的家畜，應(yīng)用市場十分廣泛。高效肌肉特異性啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)外源基因在骨骼肌細(xì)胞中的高效表達(dá)，對于提高轉(zhuǎn)基因家畜肉的生產(chǎn)具有重要意義。結(jié)蛋白是肌組織中重要的細(xì)胞骨架蛋白，是中間纖維主要成分之一，其在肌肉形態(tài)的形成與維持、肌細(xì)胞的分化凋控、細(xì)胞之間的信息傳遞等諸多方面發(fā)揮著重要作用。結(jié)蛋白基因

2、啟動(dòng)子可以指導(dǎo)外源基因的特異性表達(dá)，但是作為畜牧生產(chǎn)所需的啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性不夠，因此利用分子克隆技術(shù)對結(jié)蛋白基因啟動(dòng)子片段進(jìn)行改造，我們希望獲得一個(gè)具有較高啟動(dòng)活性和肌肉組織特異性的啟動(dòng)子。
　　本實(shí)驗(yàn)以desmin300啟動(dòng)子為研究對象，通過PCR擴(kuò)增desmin300中含有多個(gè)正調(diào)控元件的序列，將其連入desmin300上游，構(gòu)建含有多個(gè)正調(diào)控元件的序列的重組啟動(dòng)子;將含有α-actin基因啟動(dòng)子以及MyoG基因啟動(dòng)子的部分

3、調(diào)控元件的序列，連到desmin300啟動(dòng)子當(dāng)中，構(gòu)建含有兩拷貝調(diào)控元件的重組啟動(dòng)子;將多拷貝調(diào)控元件與desmin300進(jìn)行串聯(lián)，構(gòu)建含有多拷貝調(diào)控元件的重組啟動(dòng)子;構(gòu)建真核表達(dá)載體;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，檢測改造后的牛desmin基因啟動(dòng)子的活性和肌肉特異性。
　　具體研究結(jié)果如下:
　　1.利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)牛結(jié)蛋白基因啟動(dòng)子300 bp調(diào)控區(qū)有3個(gè)CTCF、1個(gè)CPBP、1個(gè)MyoD、2個(gè)EG

4、RF、1個(gè)AP2、1個(gè)Pax3、1個(gè)TFIIB、1個(gè)Sp1等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.應(yīng)用PCR定點(diǎn)突變的方法，定點(diǎn)突變牛desmin300啟動(dòng)子片段中的CTCF元件，并構(gòu)建pGL3-desmin300-CTCF質(zhì)粒，通過熒光素酶報(bào)告檢測啟動(dòng)子活性發(fā)現(xiàn)，突變CTCF元件后，在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的突變啟動(dòng)子pGL3-desmin300-CTCF的活性低于野生型單啟動(dòng)子pGL3-desmin300，證明CTCF轉(zhuǎn)錄元件為牛des

5、min啟動(dòng)子的正調(diào)控元件。
　　3.我們將野生型啟動(dòng)子pGL3-desmin300以及定點(diǎn)突變后的啟動(dòng)子pGL3-desmin300-CTCF，分別和含有CTCF的外源基因pMy-CTCF-GFP共轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明，突變啟動(dòng)子的活性和其與外源基因共轉(zhuǎn)染后的活性相近，而野生型啟動(dòng)子和外源基因共轉(zhuǎn)染后的活性要明顯高于野生型啟動(dòng)子的活性，這證明CTCF元件在結(jié)蛋白啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控位點(diǎn)相結(jié)合并對轉(zhuǎn)錄有著正調(diào)控作用。
　　4

6、.將含有α-actin基因啟動(dòng)子以及MyoG基因啟動(dòng)子的部分調(diào)控元件的序列，連到牛desmin啟動(dòng)子當(dāng)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-MD-αD①-desmin300和pGL3-αD②-αD①-desmin300。結(jié)果表明，pGL3-MD-αD①-desmin300和pGL3-αD②-αD①-desmin300的啟動(dòng)子活性分別是野生型啟動(dòng)子pGL3-desmin300的2.56和2.88倍，說明改造后的啟動(dòng)子片段具有較高的啟動(dòng)活性且具有肌肉特

7、異性。
　　5.我們進(jìn)一步的又將PCR擴(kuò)增的含有多個(gè)正調(diào)控元件的DOUBLE序列連入含有兩拷貝調(diào)控元件的重組啟動(dòng)子中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改造后的重組啟動(dòng)子活性會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)并且仍然具有肌肉特性，重組啟動(dòng)子pGL3-MD-αD①-desmin300-DOUBLE3，pGL3-αD②-αD①-desmin300-DOUBLE3，pGL3-MD-αD①-desmin300-DOUBLE2，pGL3-αD②-αD①-desmin300-DOUBLE