棉花基因GhHOX2啟動(dòng)子的克隆與功能分析.pdf

1、我國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費(fèi)國。棉花生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟(jì)中有著非常重要的地位。棉花纖維細(xì)胞是由胚珠外表皮細(xì)胞分化而成，其整個(gè)發(fā)育過程中都是以單細(xì)胞形式存在。在表皮細(xì)胞突起后，纖維細(xì)胞迅速伸長，可以將細(xì)胞的分化與細(xì)胞的伸長發(fā)育過程完全分開。隨著纖維細(xì)胞生長發(fā)育的進(jìn)行，細(xì)胞形態(tài)變化越來越大，最后其長/徑比可達(dá)1，000-3,000。棉纖維分化、發(fā)育過程表現(xiàn)出的這些特點(diǎn)使之成為研究植物細(xì)胞分化、伸長及纖維素生物合成的理想材料。纖維細(xì)胞的分

2、化發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，在這個(gè)過程中，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起著十分重要的作用。但目前對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控棉花纖維分化發(fā)育的研究還處于初步階段，僅有少數(shù)轉(zhuǎn)錄因子基因得到克隆。GhHOX2是從發(fā)育中的棉花纖維細(xì)胞中克隆的一個(gè)Homeobox(同源異型盒)基因，為了研究GhHOX2基因啟動(dòng)子功能，本研究通過改良的YADE法從陸地棉基因組中克隆了GhHOX2的5’上游啟動(dòng)子序列，將所克隆的啟動(dòng)子與GUS基因融合構(gòu)建表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化手段

3、將其轉(zhuǎn)入煙草，分析了啟動(dòng)子的功能，獲得的主要結(jié)果如下： 1.GhHOX2基因的基因組結(jié)構(gòu)分析和表達(dá) 分析Southem雜交分析表明，GhHOX2基因?yàn)槎嗫截惢?，在陸地棉基因組中有兩個(gè)子拷貝。通過RT-PCR檢測GhHOX2基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在陸地棉的根、莖、真葉、子葉、花蕾、花冠、9d纖維和胚珠中均有表達(dá)，為組成性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因。Real-time PCR對(duì)GhHOX2基因表達(dá)定量分析結(jié)果表明：GhHOX2基因在

4、各組織器官中的表達(dá)量有差異，在陸地棉的子葉和花冠的相對(duì)表達(dá)量最高，而在根、花蕾和纖維中的相對(duì)表達(dá)量較低。 2.GhHOX2基因啟動(dòng)子序列的克隆 獲得了GhHOX2基因的基因組序列，全長4.29kb，其中含有10個(gè)內(nèi)含子、11個(gè)外顯子，有兩個(gè)Hind Ⅲ位點(diǎn)。根據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)引物，采用改良的YADE方法進(jìn)行啟動(dòng)子克隆，得到了GhHOX2基因5’上游1218bp序列。根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)引物，從陸地棉基因組中擴(kuò)增出GhHOX2

5、基因兩個(gè)不同的啟動(dòng)子，命名為pHOX2-1和pHOX2-2，分別為1218bp和1195bp。序列分析表明，pHOX2-1與pHOX2-2有85％的序列完全相同，不同的部分主要出現(xiàn)在-1140～-483位置。其中pHOX2-1內(nèi)部有一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)，而pHOX2-2則有兩個(gè)。對(duì)啟動(dòng)子與部分基因編碼區(qū)序列(包括一個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子)進(jìn)行擴(kuò)增，得到了兩個(gè)不同的克隆，測序結(jié)果表明分別為pHOX2.1和pHOX2-2與相同的編碼區(qū)序列，證明

6、了兩個(gè)啟動(dòng)子同為GhHOX2基因的啟動(dòng)子。后通過對(duì)雷蒙德氏棉、非洲棉和亞洲棉HOX2基岡的啟動(dòng)子分析，結(jié)果表明pHOX2-1可能來源于雷蒙德氏棉的D5染色體組，pHOX2-2可能來源于非洲棉的A1染色體組。 3.GhHOX2基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析 為了研究GhHOX2基因啟動(dòng)子的功能，構(gòu)建了啟動(dòng)子與GUS基因融合構(gòu)建表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化手段將其轉(zhuǎn)入煙草中。 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS化學(xué)組織染色結(jié)果表明，p

7、HOX2-2啟動(dòng)子在煙草的莖、花托和開花當(dāng)天的子房有表達(dá)外，在萼片中也有微弱表達(dá)。而pHOX2-1啟動(dòng)子僅在煙草的花托和開花當(dāng)天的子房有表達(dá)。 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS熒光酶活定量分析表明，pHOX2-2在子房中的GUS酶活最高，達(dá)到3445.81pmol/mg/min，但僅為CaMV35S啟動(dòng)的GUS酶活的3％；花托中的GUS酶活達(dá)到3192.98pmol/mg/min，為CaMV35S啟動(dòng)的GUS酶活的2.2％；莖中的GUS酶活達(dá)

8、到2178.36 pmol/mg/min，為CaMV35S啟動(dòng)的GUS酶活的1％。pHOX2-1在子房中的GUS酶活最高，達(dá)到875.61pmol/mg/min，只有pHOX2-2啟動(dòng)活性的25％，CaMV35S啟動(dòng)活性的0.77％；在花托中的啟動(dòng)活性達(dá)到501.63 pmol/mg/min，為pHOX2-2啟動(dòng)活性的15.7％，CaMV35S啟動(dòng)活性的0.38％。結(jié)果暗示，pHOX2-1與pHOX2-2由于在序列結(jié)構(gòu)上有15％的堿基不