麥谷蛋白基因及甲硫氨酸亞砜還原酶基因啟動(dòng)子功能分析.pdf

1、利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)有重要價(jià)值的外源蛋白的技術(shù)成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一。目前，該技術(shù)的一個(gè)重要且急需解決的課題是使外源蛋白基因高效且特異性地在植物特定組織器官如胚乳中表達(dá)，那么尋找高效啟動(dòng)子的工作就成為一個(gè)關(guān)鍵因素。麥谷蛋白是小麥籽粒中主要的儲(chǔ)藏蛋白，能夠特異性地在胚乳中大量表達(dá)，因此其啟動(dòng)子可以作為候選啟動(dòng)子用于植物反應(yīng)器中。關(guān)于小麥在這方面的研究，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因技術(shù)的瓶頸而進(jìn)展較小。
　　麥谷蛋白基因的啟動(dòng)子由核心

2、啟動(dòng)子區(qū)和上游調(diào)控元件組成，只有兩者組合在一起時(shí)才能啟動(dòng)基因高效且特異地表達(dá)。本研究首先探索了使用基因槍轟擊小麥幼嫩的種子，研究谷蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在種子表層表達(dá)的可行性，染色結(jié)果表明在果皮、種皮和胚乳的外層均有染色;接著我們使用中國(guó)春小麥的9個(gè)全長(zhǎng)麥谷蛋白基因啟動(dòng)子(包括了5個(gè)高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)基因和4個(gè)低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)基因）構(gòu)建了GUS表達(dá)載體，利用基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化了幼嫩的小麥籽

3、粒，經(jīng)染色后發(fā)現(xiàn)它們均能驅(qū)動(dòng)GUS基因在籽粒外層細(xì)胞表達(dá)。其中HMW-GS基因中Bx7啟動(dòng)子的功能要強(qiáng)于其它的HMW-GS啟動(dòng)子，而Ay啟動(dòng)子則是所有啟動(dòng)子中功能最弱的;在LMW-GS基因中，Glu-A3-1和Glu-B3-1啟動(dòng)子的功能相對(duì)較強(qiáng)，Glu-D3-2啟動(dòng)子的功能最弱。需要指出的是，Ay亞基在中國(guó)春中是不表達(dá)的，但該基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因有較弱的表達(dá)。為了研究小麥谷蛋白啟動(dòng)子中保守元件RY-element的功能，我們利用

4、重疊引物技術(shù)在該保守結(jié)構(gòu)域中引入突變，構(gòu)建了By8亞基基因啟動(dòng)子突變體+GUS的表達(dá)載體，基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表明該元件的突變導(dǎo)致GUS表達(dá)水平顯著降低。生物信息學(xué)分析表明LMW-GS基因啟動(dòng)子的5'端遠(yuǎn)端(＞1 kb)的序列中沒(méi)有順式作用元件，為了探討該類啟動(dòng)子遠(yuǎn)端實(shí)際上是否存在影響表達(dá)的序列，我們分別構(gòu)建了Glu-D3-1啟動(dòng)子的全長(zhǎng)和972 bp序列驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)載體，基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表明972 bp的啟動(dòng)子也能高效地啟動(dòng)GUS的表達(dá)，

5、與全長(zhǎng)序列相比，功能變化不顯著。
　　甲硫氨酸亞砜還原酶(MSR)可以特異還原對(duì)Met的氧化，因此研究其啟動(dòng)子的功能有利于理解該基因在機(jī)體防御中的重要作用。本課題組在此前的研究中克隆獲得了多個(gè)小麥MSR基因，已有的研究表明TaMSR A4.1和-B3.1的過(guò)表達(dá)擬南芥株系表現(xiàn)出明顯的抗逆效應(yīng)。為了深入了解其功能，我們利用生物信息學(xué)拼接獲得了這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)了啟動(dòng)子特異性的引物，通過(guò)梯度PCR的方法從抗逆小麥品種山融3號(hào)

6、的基因組中克隆獲得了它們的啟動(dòng)子序列，分別長(zhǎng)達(dá)1898和1787 bp。通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了序列中的保守順式作用元件，包括ABA響應(yīng)元件ABRE、GA響應(yīng)元件GARE-box和P-box、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA、MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)MBS以及一些與組織特異性表達(dá)有關(guān)的元件如Skn-1 motif、 GCN4和as-2 box等。同時(shí)，我們構(gòu)建了它們的GUS表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化了模式植物擬南芥，目前T0代陽(yáng)性擬南芥植株的篩選工作正在進(jìn)行