玉米LEG基因啟動(dòng)子克隆與功能分析.pdf

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意?？?，學(xué)位論文作者簽名：=塹叢簽字日期：扣，≯年易月歸學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書’本學(xué)位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、

2、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)。學(xué)位論文作者簽名：拯簽字日期：扣f≯年』5月莎曰學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通信地址：指導(dǎo)教師簽名：簽字日期

3、：小陟年么月滬電話：郵編：摘要玉米作為世界上最大的糧食作物之一，種子中貯存著豐富的蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪，是人類食用植物蛋白的主要來源，在基因工程中可用作生物反應(yīng)器，在醫(yī)療和工業(yè)領(lǐng)域中也具有重要研究?jī)r(jià)值。外源基因能否在植物細(xì)胞中定向、安全和高效表達(dá)是當(dāng)前人們非常關(guān)注的問題，而解決這一問題的關(guān)鍵是獲得能使外源基因在特定組織和器官或特定發(fā)育階段表達(dá)的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子作為重要的順式作用元件，能與不同的反式作用因子協(xié)調(diào)起作用，調(diào)控基因在特定組織和特定

4、階段表達(dá)。特異性啟動(dòng)子在玉米中的研究，不僅對(duì)增加玉米產(chǎn)量和改良玉米品質(zhì)有重要作用，而且為植物基因工程研究提供了重要的調(diào)控元件。本研究主要涉及對(duì)LEG基因啟動(dòng)子及其缺失片段的表達(dá)載體的構(gòu)建和功能分析，結(jié)果如下：(1)從玉米B73自交系基因組中克隆了一段1910bpLEG基因啟動(dòng)子，以其為模板，通過5’端缺失法，獲得五段不同長(zhǎng)度的缺失片段，分別命名為TLEGl、TLEG2、TLEG3、TLEG4和TLEG5，大小分別為1596bp、1312

5、bp、1000bp、703bp和360bp；將這六段啟動(dòng)子分別與含有GUS報(bào)告基因的雙元表達(dá)載體pCAMBIAl301連接，構(gòu)建六個(gè)新型的表達(dá)載體；(2)通過PLACE和PlantCARE網(wǎng)站分析，該啟動(dòng)子除含有TATAbox和CAATbox基本元件外，還含有三種光應(yīng)答元件：Box4、GAGmotif和Spl；七種誘導(dǎo)性元件：AuxRR—core、P—box、ABRE、CGTCA—motif、TGACGmotif、MBS和LTR；三種器

6、官表達(dá)元件：ROOTMOTIFTAPOXl、REALPHALGLHCB21和RAVlAAT；W1Box是一種WRKY蛋白結(jié)合位點(diǎn)；(3)以植物材料粳稻(OryzasativaLsubspjaponica)中花11號(hào)為試材，以愈傷組織為侵染對(duì)象，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化將各載體到水稻細(xì)胞中。獲得60株轉(zhuǎn)基因株，分別為pLEG5株，TLEGl6株、TLEG2轉(zhuǎn)12株、TLEG314株、TLEG411株和T皿G514株，，通過PCR和Southe

7、m雜交檢測(cè)，共45株為陽性植株；(4)通過GUS組織化學(xué)染色驗(yàn)證LEG基因啟動(dòng)子只在愈傷組織細(xì)胞中表達(dá)，葉、莖、葉芽鞘、根、花、穎殼和種子均不表達(dá)；為了進(jìn)一步了解其表達(dá)強(qiáng)度，對(duì)該啟動(dòng)子T代愈傷組織進(jìn)行GUS熒光活性檢測(cè)，以平均表達(dá)強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，為非轉(zhuǎn)基因株的13倍之多，但略低于35S啟動(dòng)子。篩減片段的GUS組織化學(xué)染色分析結(jié)果表明：TLEGl只在愈傷組織細(xì)胞中表達(dá)，其它各部位均不表達(dá)；TLEG2、TLEG3、TLEG4和TLEG5除在愈傷