腸道病毒柯薩奇B5型巢式RT-PCR檢測方法的建立及評價.pdf

1、目的:
　　 病毒性腦炎（ViralEncephalitis）是兒童時期常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、抽搐、意識障礙和腦膜刺激征等，易造成不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，嚴(yán)重威脅兒童身心健康。近年來，河南省發(fā)生了多起病毒性腦炎的暴發(fā)，經(jīng)檢測主要是由柯薩奇病毒B5(coxsachievirusB5，CVB5)引起?？滤_奇病毒B5是一種常見的能引起病毒性腦炎的腸道病毒，屬于腸道病毒屬小核糖核酸病毒，無包膜，單股正

2、鏈RNA，資料顯示其引起的病毒性腦炎在我國廣泛存在。
　　 病原的分離培養(yǎng)與PCR擴(kuò)增測序是鑒定CVB5的主要方法和金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其缺乏敏感性、檢出率低、耗費(fèi)時間長且費(fèi)用高，臨床上極少采用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)做為一種新的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，具有操作簡單、快速、靈敏度和特異度高、易標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，已被越來越多地應(yīng)用到腸道病毒診斷上來。但文獻(xiàn)中鮮見檢測腸道病毒CVB5的PCR方法，所以本文通過建立一種簡單、快速、靈敏、特異的檢測

3、CVB5的巢式PCR方法，將其與其它腸道病毒，如Echo6、EV71、CVA16等進(jìn)行鑒別，也為以后CVB5感染的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測提供了一種更為可靠的手段。
　　 方法:
　　 從GenBank下載河南分離株CVB5全基因序列，用DNAStar軟件進(jìn)行同源性比較，在同源性較高的區(qū)域選擇出引物設(shè)計(jì)的模板，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，用PrimerPremier5.0在VP1區(qū)設(shè)計(jì)了三對巢式PCR引物，并用Blast和Olig

4、o6.0軟件對其進(jìn)行比對和分析評價。最終將這三對巢式PCR引物合成并進(jìn)行擴(kuò)增后，通過凝膠成像方法進(jìn)行驗(yàn)證確定最終選擇的引物。提取病毒標(biāo)準(zhǔn)株RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，并對其靈敏度、特異度和重復(fù)性進(jìn)行評價，最終建立了一種快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測腸道病毒CVB5的巢式RT-PCR方法。用建立的巢式RT-PCR方法對新采集的212份病毒性腦炎患者樣本進(jìn)行檢測，同時與做為金標(biāo)準(zhǔn)的病毒分離檢測方法進(jìn)行比較評價其應(yīng)用價

5、值。病原的確定通過將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序后，先用DNAStar軟件的SeqMan將測定到的核酸序列進(jìn)行人工輔助校對，再用NCBI軟件進(jìn)行同源性比較，與GenBank公布的序列進(jìn)行比對分析，核酸序列比對分析利用DNAStar7.0完成。
　　 結(jié)果:
　　 1.以病毒標(biāo)準(zhǔn)株反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，最終確定兩輪擴(kuò)增反應(yīng)總體系均為50μl，包括PCR反應(yīng)液25μl、cDNA模板1μl、上下游引物各1μl、無RNA酶去

6、離子水22μl。在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中，取第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物1μl作為模板。反應(yīng)條件為:94℃3min;94℃，30s，56℃30s，72℃30s，30個循環(huán);72℃10min;4℃，∞。第二輪反應(yīng)條件除了將第一輪的30個循環(huán)改為25個循環(huán)外，其他與第一輪相同。
　　 2.方法學(xué)評價結(jié)果:敏感性:將CVB5標(biāo)準(zhǔn)株選用RD細(xì)胞進(jìn)行病毒效價滴定，然后10倍梯度倍比稀釋進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，成像結(jié)果顯示第一輪的靈敏度達(dá)到10TCID50，第二輪的靈

7、敏度達(dá)到10-4TCID50;特異性:將5株不同的CVB5毒株和Echo25、EV71等4株其他腸道病毒毒株及空白對照進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后，5株CVB5毒株兩輪成像結(jié)果均在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶，而其他毒株及陰性對照均無目的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果一致。重復(fù)性:分別用已建立的檢測方法將CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性腦炎病例樣本用已建立的檢測方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果均一致。
　　 3.分別用建立的巢式RT-PCR方法和