雙重熒光定量RT-PCR法檢測柯薩奇病毒A2-A5型或A6-A10型技術的建立與應用.pdf

1、手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由人類腸道病毒(humanenterovirus，HEV)引起的一類兒童常見傳染病。人類腸道病毒目前共有90多種基因型，分為A、B、C、D共4個組，其中最主要的病原體是HEV-A組中的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVA16)。但越來越多的研究表明，HEV中的一些其他血清型，如CVA2、CVA5、CVA

2、6、CVA10型等也是引起HFMD的常見病原。當前，許多國家和地區(qū)爆發(fā)了以CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型為主的手足口病，而浙江省卻沒有相關的報道。CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型這四種病原體檢測也沒有相對及時、高效、準確、便捷的檢測試劑盒。我國的HFMD病原診斷市場，仍然以檢測腸道病毒通用型或EV71型和CVA16型為主，導致HFMD病原體檢測不明確或漏檢等，造成患者治療的延誤及診斷試劑的浪費等。因而開發(fā)一種針對C

3、VA2、CVA5、CVA6、CVA10型病原檢測的診斷試劑迫在眉睫。為了快速準確鑒別診斷由CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型引起的HFMD，本研究擬采用RT-PCR技術同時檢測CVA2/CVA5型或CVA6/CVA10型四種亞型，并通過建立的此方法進行臨床應用。
　　第一部分 雙重熒光定量RT-PCR法檢測柯薩奇病毒A2/A5型或柯薩奇病毒A6/A10型方法的建立
　　方法:
　　1.從美國NCBI基因庫下載了

4、涵蓋國內外CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型的多條基因序列。利用DNAman軟件對其進行了同源性比較，確定以上病毒基因組的保守區(qū)。使用Primer Express3.0軟件在其保守區(qū)設計高度特異性的引物與TaqMan探針，引物和探針序列均通過Blast驗證，并對兩對引物及探針濃度進行優(yōu)化。
　　2.通過優(yōu)化后反應體系，利用CVA2、CVA5、CVA6、CVA10型核酸片段和EV71型、CVA16型、CVB1型、CVB3型、

5、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的陽性核酸等分離株評價該法的特異性，對已標定拷貝數(shù)的標準品進行稀釋，平行進行熒光定量RT-PCR反應，比較其靈敏度。分別取CVA2型、CVA5型、CVA6型、CVA10型合成片段（終濃度均為106copies/ml）按10倍梯度稀釋成4個不同的濃度，對每一個濃度的陽性核酸稀釋液作6次重復檢測，得到的CT值計算其標準差和變異系數(shù)，驗證該方法的重復性。
　　結果:
　　1.

6、通過優(yōu)化引物探針組合濃度，雙重熒光RT-PCR結果表明本實驗所選的引物和探針檢測CVA2、CVA5型與CVA6型、CVA10型、EV71型、CVA16型、CVB1型、CVB3型、?？瞬《?0型，及甲型流感病毒、呼吸遒合胞病毒、博卡病毒的陽性核酸均無交叉反應，具有高度的特異性。該方法具有較高靈敏度，其最低檢測限達到102copies/mL。對每一個濃度的樣本作6個重復檢測，結果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標準差在0.13～0.28之間，批

7、內變異系數(shù)(CV)均＜1.33％，并具有較好的重復性。
　　2.通過優(yōu)化引物探針組合濃度，雙重熒光RT-PCR結果表明本實驗所選的引物和探針檢測CVA6、CVA10型與CVA2型、CVA5型、EV71型、CVA16型、CVB1型、CVB3型、?？瞬《?0型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的陽性核酸均無交叉反應，具有高度的特異性。該方法具有較高靈敏度，其最低檢測限達到102 copies/mL，對每一個濃度的樣本作6個重復

8、檢測，結果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標準差在0.14～0.28之間，批內變異系數(shù)(CV)均＜1.44％，并具有較好的重復性。
　　結論:
　　成功建立了單管中能同時檢測并鑒別CVA2、CVA5型雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法與單管中能同時檢測并鑒別CVA6、CVA10型雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法。該檢測方法全封閉單管擴增、簡便快捷、重復性好、實時定量、污染少等優(yōu)勢，克服了以往臨床診斷的缺陷，具有高度的特異性

9、和敏感性，為臨床診斷提供了準確可靠的實驗室依據(jù)，可作為一種臨床病原診斷的有效、快速的檢測手段。
　　第二部分 雙重熒光定量RT-PCR法檢測柯薩奇病毒A2/A5型或柯薩奇病毒A6/A10型方法的臨床應用
　　方法:
　　用建立的雙重熒光定量RT-PCR法分別對2013年3月至2013年6月浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院以及杭州市兒童醫(yī)院和湖州市中心醫(yī)院的手足口病患者及疑似患者糞便標本總共367份進行CVA2、CVA5型病原

10、體檢測和2013年3月至2013年9月間浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院以及杭州市兒童醫(yī)院和湖州市中心醫(yī)院的手足口病患者及疑似患者糞便標本總共419份進行CVA6、CVA10型病原體檢測，并對結果進行統(tǒng)計分析。隨機選擇10株CVA2、CVA5陽性標本進行測序驗證，然后測序結果通過NCBI BLAST程序與Gen Bank中的病毒核苷酸序列比對，確定病毒型別。用MEGA4.0進行序列和進化分析，用Kimura雙參數(shù)模型計算毒株間的遺傳距離，用N

11、J法構建進化樹;用Vector NTI AlignX程序計算毒株序列同源性。
　　結果:
　　采用本方法中的熒光定量RT-PCR法對收集到的標本進行驗證，檢測結果如下:收集的367份大便標本中，CVA2型陽性23份，陽性率6.3％;CVA5型陽性11份，陽性率3.0％。收集的419份大便標本中，CVA6型陽性171份，陽性率40.8％;CVA10型陽性27份，陽性率6.4％。檢測陽性結果與測序結果完全相符。測序的CVA2株、

12、CVA5株VP1區(qū)核苷酸序列均具有高度的一致性，與周邊國家或地區(qū)CVA2的核苷酸同源性為92.3％～99％，CVA5核苷酸同源性為92％～97.8％。在2012年至2013年間以CVA2、CVA5、CVA6、CVA10引起的手足口病，病原體呈大流行趨勢，親緣關系較近沒有隨遷徙而變異。
　　結論:
　　該檢測方法能對CVA2、CVA5型與CVA6、CVA10型進行病原體檢測，并提供病原體滴度，從而減少了病原體不明確或漏檢，及診