腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、手足口病是兒童中常見的腸道病毒感染性疾病,腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)是其主要病原。手足口病的傳染主要通過糞-口和口-口途徑,其中接觸感染者糞便污染的水、食物及土壤可以導(dǎo)致糞-口傳播。水是生命之源,由于干凈安全飲用水的缺乏,世界上每年都有大量人群發(fā)生疾病和死亡。近年來,EV71的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢(shì),甚至引起嚴(yán)重中樞感染或死亡,引起人們的密切關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測(cè)手足口病病原的方法通常需要5-7d才能完

2、成,而且操作繁瑣、靈敏度較低,不能滿足臨床上快速、靈敏的檢測(cè)需要。因此,建立糞便及飲用水源水中手足口病病原快速、靈敏的檢驗(yàn)方法,對(duì)疾病的預(yù)防和輔助檢測(cè)、評(píng)估水源衛(wèi)生質(zhì)量和環(huán)境衛(wèi)生狀況具有重要的實(shí)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 目的:建立并優(yōu)化EV71和CoxA16的LAMP檢測(cè)體系,應(yīng)用于手足口病的病原檢測(cè)。建立EV71和CoxA16的實(shí)時(shí)RT-LAMP檢測(cè)方法并定量檢測(cè)天津市飲用水源水樣品。
　　 方法:
　　 1、

3、本研究基于EV71和CoxA16病毒基因組VP1區(qū)利用軟件設(shè)計(jì)出LAMP反應(yīng)的外引物和內(nèi)引物。并對(duì)反應(yīng)溫度、鎂離子濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。LAMP反應(yīng)的總反應(yīng)體系為25μL,EV71和CoxA16反應(yīng)混合物分別在62℃和63℃孵育60min,然后在80℃加熱10min終止反應(yīng)。LAMP反應(yīng)結(jié)束后通過以下幾種方法判斷擴(kuò)增是否發(fā)生:一是肉眼觀察反應(yīng)管的混濁度或向反應(yīng)管中加入SYBR Green I型染料后觀察反應(yīng)

4、管顏色的變化,二是通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),此外也可通過酶切鑒定LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)6株腸道病毒分別進(jìn)行了LAMP反應(yīng)來驗(yàn)證引物的特異性,構(gòu)建EV71和CoxA16標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板,梯度稀釋后驗(yàn)證LAMP反應(yīng)的靈敏性。
　　 2、采集60例天津地區(qū)手足口病流行期間手足口病患兒的糞便標(biāo)本,分別用EV71和CoxA16的特異性引物對(duì)分離到的病毒RNA進(jìn)行LAMP及PCR檢測(cè)。
　　 3、本研究于2010年1月至2010年11月,采

5、集18個(gè)天津市飲用水源水樣品。用超濾離心管濃縮500 mL水樣,提取總RNA。實(shí)時(shí)RT-LAMP分別檢測(cè)飲用水源水中的EV71和CoxA16。
　　 結(jié)果:
　　 1、該方法對(duì)EV71和CoxA16的檢測(cè)有高度的特異性,與甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇B3、柯薩奇B5、?？?0及柯薩奇A16/腸道病毒71型等病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。LAMP檢測(cè)CoxA16的靈敏性比傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法高100倍,檢測(cè)EV71的靈敏性比傳

6、統(tǒng)的.PCR檢測(cè)方法高10倍。
　　 2、LAMP檢測(cè)EV71的檢出率(31/60=51.7％)高于PCR(27/60=45％),LAMP檢測(cè)CoxA16的檢出率與PCR相當(dāng)(27/60=45％)。說明這次手足口病流行的主要病原是EV71,同時(shí)存在CoxA16的散發(fā)。通過兩種方法的比較,可知LAMP比PCR更快速、靈敏,有著更為廣泛的發(fā)展前景。
　　 3、超濾離心管濃縮病毒的回收率為34.83％。濁度儀實(shí)時(shí)RT-LAMP